«8D05107 - Биология» білім беру бағдарламасы бойынша философия докторы (PhD) дәрежесін алу үшін Иқсат Нұргүл Нұрқанатқызы диссертациясын қорғауы
Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінде философия докторы (PhD) дәрежесін алу үшін Иқсат Нұргүл Нұрқанатқызы «8D05107 – Биология» білім беру бағдарламасы бойынша «Патогенге қарсы өсімдіктердің төзімділігін ынталандыру мақсатында РНҚ вирусының селективті танылуы мен гидролизін модуляциялау» тақырыбында диссертациясы қорғалады.
Диссертациялық жұмыс Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің Рустем Омаров атындағы өсімдіктер биотехнологиясының ғылыми зертханасы (Астана қ., Қазақстан) мен Тарас Шевченко атындағы Киев ұлттық университетінде (Киев қ., Украина) орындалған.
Қорғау тілі - қазақ тілінде
Ресми рецензенттер:
Бисенбаев Амангельды Куанбаевич – Қазақстан Республикасы Ұлттық ғылым академиясының академигі, биология ғылымдарының докторы, әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университетінің молекулалық биология және генетика кафедрасының профессоры (Алматы қ., Қазақстан Республикасы).
Сапахова Загипа Бейсеновна – философия ғылымдарының докторы (PhD), қауымдастырылған профессор, Өсімдіктер биологиясы және биотехнологиясы институтының селекция және биотехнология зертханасының жетекші ғылыми қызметкері (Алматы қ., Қазақстан Республикасы).
Диссертациялық кеңестің уақытша мүшелері:
Жамбакин Кабыл Жапарович – Қазақстан Республикасы Ұлттық ғылым академиясының академигі, профессор, биология ғылымдарының докторы, Өсімдіктер биологиясы және биотехнологиясы институтының бас директоры (Алматы қ., Қазақстан Республикасы).
Солтабаева Айгерим Даулетбеккызы - философия ғылымдарының докторы (PhD), қауымдастырылған профессор, биология инструкторы, жаратылыстану-әлеуметтік-гуманитарлық ғылымдар мектебі, Назарбаев университеті (Астана қ., Қазақстан Республикасы).
Джатаев Сатывалды Адинеевич – биология ғылымдарының докторы, С. Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университетінің егін шаруашылығы және өсімдік шаруашылығы кафедрасының қауымдастырылған профессоры (Астана қ., Қазақстан Республикасы).
Бектурова Айзат Жамбуловна - философия ғылымдарының докторы (PhD), Бар-Илан университетінің постдокторанты (Израиль).
Ғылыми кеңесшілер:
Масалимов Жаксылык Каирбекович – философия ғылымдарының докторы (PhD), биология ғылымдарының кандидаты, Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің биотехнология және микробиология кафедрасының меңгерушісі, қауымдастырылған профессор (Астана қ., Қазақстан Республикасы).
Алекс Шевченко – философия ғылымдарының докторы (PhD), Тарас Шевченко атындағы Киев ұлттық университетінің қауымдастырылған профессоры (Киев қ., Украина).
Қорғау 2024 жылғы 29 сәуір, сағат 12:00 Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің «8D05107 – Биология» мамандығы бойынша «8D051 – Биологиялық және сабақтас ғылымдар» кадрларды даярлау бағыты бойынша диссертациялық кеңесте өтеді. Диссертациялық кеңес мәжілісі онлайн форматта өткізіледі деп жоспарлануда.
Сілтемесі: https://us06web.zoom.us/j/86278516508?pwd=Jk0PZm4ahGLzEBWI1bPaPy6plvIfbQ.1
Конференция идентификаторы: 862 7851 6508 Кіру коды: 609988
Мекен-жайы: Астана қаласы, Қажымұқан көшесі, 13 үй, №3 ғимарат, №333 аудитория
Аңдатпа (қаз.): Зерттеудің жалпы сипаттамасы. Диссертациялық жұмыс CRISPR/Cas13 жүйесін пайдалана отырып, өсімдіктердегі қызанақтың бұталы ергежейлігінің вирусына (Tomato Bushy Stunt Virus, TBSV) қарсы тұрақтылықты орнату үшін арналған зерттеулерді сипаттайды. Сонымен қатар, осы зерттеуде өсімдіктерді термиялық өңдеу мен РНҚ-интерференцияның супрессоры P19 ақуызымен ко-трансформациялау арқылы CRISPR/Cas13 жүйесінің тиімділігін арттырып, вирустық патогендерге қарсы тиімді қорғаныс стратегияларын жасау мүмкіндіктері сипатталған. Берілген жұмыста молекулалық биология мен гендік инженерияның әдістері қолданылған. Зерттеу тақырыбының өзектілігі. Дүниежүзінде өсімдіктердің вирустары егіннің сапасы мен мөлшерін төмендетіп, ауылшаруашылық дақылдардың өндірісіне айтарлықтай зиянын келтіреді. Қазақстанда вирустар дақылдарға зиянын келтіріп, айтарлықтай экономикалық шығындарға әкеледі. Осыған байланысты, вирустық патогендерге қарсы өсімдіктердің төзімділігін арттыру мақсатында жаңа әдістерді жасау өсімдіктер биологиясы саласында маңызды рөл атқарады. CRISPR технологиясы өсімдіктердің өнімділігі мен қоршаған ортаның биотикалық және абиотикалық стресс факторларына тұрақтылығын арттыруында жаңа мүмкіндіктерді ашуда. Әсіресе, CRISPR-ді бағыттаушы молекулалар ретіндегі вирустық реттіліктерімен қоса пайдалану, вирусқа төзімді өсімдіктер линияларын алуға жағдай туғызады. Соңғы зерттеулер бойынша, CRISPR/Cas9 жүйесі вирустық нуклеин қышқылдарына талғамалы әсер ету арқылы өсімдіктерде иммунитет қалыптастыру үшін тиімді қолданыла алады. Сондай-ақ, бұл тәсіл қожайынның сезімталдығымен, әсіресе РНҚ вирустары кезінде, байланысты гендерге арнайы бағытталуына жағдай туғызады. Бағыттаушы РНҚ-сы бар CRISPR құрылымдарын әр түрлі жеткізу жүйелерін, соның ішінде бастысы - CRISPR гендерінің транзиентті экспрессиясын дайындау, өсімдіктер жасушасындағы трансгендерге қарсы қорғаныш механизмдерін іске қоса алады. РНҚ негізіндегі вирусқа қарсы технологияларды жасауда CRISPR/Cas13а қолдану мүмкіндігі туралы жарияланған жұмыстар бар. CRISPR/Cas жүйесін оңтайландырудың негізгі мәселелері эукариоттық жүйелерге тасымалдау әдістері, Cas туысына жататын нуклеазалардың мРНҚ мен гидтік РНҚ экспрессиясын жоғарылату үшін оңтайлы промоторларды таңдау болып табылады. Өсімдіктерде CRISPR/Cas жүйесінің төмен экспрессиясының болу факторларының бірі бөтен мРНҚ деградациясына бағытталған РНҚ-интерференция белсенділігі болып табылады. Осыған байланысты РНҚ-интерференцияның супрессоры – Р19 ақуызымен бірге мақсатты геннің ко-экспрессия әдісі кең қолданылады. Сонымен қатар, P19 ақуызының ко-экспрессиясы арқылы, Arabidopsis өсімдіктерінде CRISPR/Cas9 өңдеу жүйесінің тиімділігін арттыруға болатыны туралы жақын арадағы зерттеулер көрсеткен болатын. Сондықтан, гендер өңдеу жүйесіндегі РНҚ-сайленсинг жолдары арасындағы функционалды өзара әрекеттесуі өте маңызды. Геном құрылымындағы айырмашылықтардан басқа, CRISPR/Cas белсенділігіне әсер ететін әртүрлі биологиялық жүйелер арасындағы тағы бір аутқитын мәселе температура болып табылады. Температура көптеген биологиялық параметрлерге әсер етеді және олардың кейбіреулері (ферменттік реакцияның кинетикасы, хроматин құрылымы, ДНҚ репарация жолдары) CRISPR/Cas-тың эукариоттық геномдарда мутация тудыруы немесе транскрипт деңгейінде жұмыс істеу, РНҚ вирустарын деградациялау қабілетіне тікелей әсер етуі мүмкін. Демек, температура организмдер бойынша барлық CRISPR/Cas тиімділігінің айқын көрінетін ауытқуына ықпал етуі мүмкін. CRISPR/Cas технологиясы Arabidopsis және Nicotiana сияқты модельдік өсімдіктерде, сондай-ақ бидай, жүгері және күріш сияқты маңызды дақылдарда сәтті қолданылды. Дегенмен, кодталмайтын гендерге бағытталған зерттеулер туралы ақпарат аз. Осы уақытқа дейін CRISPR/Cas технологиясы микроРНҚ немесе lncRNA (long non-coding RNA) гендерін жою үшін тек адам, тышқан немесе данио балығының жасушаларында қолданылған. Қазіргі уақытта өсімдіктердегі пре-микроРНҚ мен микроРНҚ-ға бағытталған CRISPR/Cas13 технологиясы туралы ақпарат жоқ. Маңызды стресстік жауаптары бар микроРНҚ-ның функционалдық сипаттамасы мен механизмін талдау болашақта төзімді сұрыптарды таңдауды жеңілдетеді. Үлгі өсімдіктердің бірі ретінде темекідегі стресске жауап ретінде микроРНҚ-ның рөлі мен молекулалық механизмі, әсіресе микроРНҚ және lncRNA-лар басқа түрлердегі стресске байланысты ncRNA-лардың (non-coding RNA) қызметін ашуға көмектеседі. Бір гендік төзімділік бірте-бірте кейбір аудандарда өсімдік шаруашылығы үшін қанағаттанарлықсыз болды, жаңа бағыттар бойынша төзімді дақылдарды дамыту бағдарламалары шұғыл қажет. Осылайша, микроРНҚ-лардың және олардың бағыттарының жетілдірілуі өсімдіктер эволюциясының маңызды құрамдас бөлігі болып табылады. Вирустардың жаңа немесе модификацияланған түрлеріне әсер ету сияқты өзгермелі орта жағдайларына бейімделу микроРНҚ-ның модификацияланған арсеналын экспрессиялайтын өсімдік түрлерін таңдау арқылы жүзеге асуы мүмкін. Зерттеудің мақсаты. РНҚ вирустары мен өсімдіктердің өзара әрекеттесу механизмдеріндегі CRISPR/Cas13 жүйесінің реттелуін зерттеу және тиімділігін бағалау. Зерттеудің міндеттері: 1. Өсімдік жасушаларында экспрессиялануға мүмкіндік беретін pk2GW7-pCas13a құрылымын жасау; 2. CRISPR/Cas13 жүйесін пайдану кезіндегі қызанақтың ергежейлі бұталы вирусының (TBSV) in planta сайленсингін зерттеу; 3. CRISPR/Cas13 жүйесінің вирустық РНҚ-ға мақсатты бағдарлану тиімділігіне әр түрлі crРНК-GFP (GFP, green fluorescent protein) мен crРНК-Р19 реттіліктерін салыстыру; 4. Вирустық инфекцияның өсімдік микроРНҚ-на әсерін зерттеу; 5. Векторлардың тиімділігін арттыру мақсатында РНҚ-интерференцияның супрессоры – Р19 ақуызының бағытталған ко-трансформациясының әсерін анықтау; 6. CRISPR/Cas13 жүйесінің экспрессиясына температуралық әсерлердің тиімділігін анықтау. Зерттеу нысаны. Nicotiana benthamiаna, Tomato Bushy Stunt virus, CRISPR/Cas13 Зерттеу әдістері: өсімдіктердегі Cas13 ортологтарының экспрессиясы үшін олардың дизайны мен конструкциясы, crРНК-GFP және crРНК-P19 экспрессионды құрылымын құрастыру, LR Gateway рекомбинационды клондау, транизентті экспрессия, in vitro транскрипция, вирустық материалмен инокуляциялау, вирустық бөлшектерді тазалаудың экспресс анализі, денатурациялаушы жағдайдағы электрофорез (SDS PAGE), вестернблот, вирустық бөлшектерді детекциялаудың экспресс анализі, иммунопреципитация, микроРНҚ бөліп алу, нативті жағдайдағы электрофорез (NATIVE PAGE), 8-оксогуанинге ИФА (иммуноферменттік анализ), сұйық-сұйық фазалық бөліну, qRT-PCR (quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction), агарозды көлденең гель-электрофорез. Зерттеудің ғылыми жаңалығы. Ұсынылған зерттеу тақырыбы қазіргі уақытта Қазақстанда зерттелмеген. Өсімдіктердегі CRISPR-делдалдық вирустық РНҚ деградациясындағы Cas13 экспрессия деңгейлеріне әртүрлі термиялық өңдеулердің әсері туралы мәліметтер аз. Сонымен қатар, бұл жұмыс алғаш рет патогендерге төзімді трансгенді өсімдіктерді шығару үшін CRISPR жүйесінің тиімділігін арттыру құралы ретінде P19 супрессорлық ақуыз экспрессиясының рөлін зерттеді. P19 экспрессиясының әртүрлі деңгейлерінің өсімдіктердегі CRISPR арқылы микроРНҚ экспрессиясын өзгерту әсері туралы ақпарат жеткіліксіз. Біріктірілген нәтижелер вирустың жылдам эволюциясымен және CRISPR/Cas механизмінен жалтарумен байланысты ең күрделі мәселелерге назар аудару үшін платформаны қамтамасыз етеді. Зерттеудің теориялық және практикалық маңыздылығы. Жоба нәтижелерінің ғылыми-техникалық әсері CRISPR технологиясын қолдана отырып, вирус пен өсімдіктің өзара әрекеттесуі туралы жаңа іргелі деректер алу болып табылады. Алынған ғылыми нәтижелерді биология және биотехнология саласындағы оқу үрдісінде пайдалануға болады. Бұл зерттеулер вирусқа төзімді өсімдіктерді жасау үшін қолданбалы зерттеулер мен тәжірибелік-конструкторлық жұмыстарға негіз бола алады. Жоба нәтижелерінің экономикалық тиімділігі мақсатты белгілері бар ауылшаруашылық өсімдіктерін алуға мүмкіндік беретін технология болып табылады, бұл өнімділікті арттыруға және өнімнің өзіндік құнын төмендетуге көмектеседі. Осы зерттеу жұмысының нәтижелеріне сүйене отырып, бір немесе бірнеше вирустарға және мүмкін басқа патогендерге қарсы CRISPR/pCas13 механизмдерін пайдалану үшін азық-түлік қауіпсіздігі үшін маңызды өсімдіктердің негізгі түрлерін құруға болады. Осы диссертациялық жұмыстың нәтижелері 2023-2025 жж. Қазақстан республикасының ЖБҒМ ҒК «Жас ғалым» жобасы AP19174389 «Өсімдіктердегі вирусқа қарсы төзімділігін ынталандыру үшін CRISPR/Cas13 гендік өңдеу жүйесін модуляциялау» мен ҚР БЖБМ 2023-2025 жж. арналған ғылыми, ғылыми-техникалық бағдарламалар бойынша бағдарламалық-нысаналы қаржыландыру BR21882269 «Экономикалық маңызды дақылдардың өнімділігін арттыру үшін геномды өңдеу технологиясын қолдану» бағдарламасы аясындағы «Өсімдіктерге антивирустық төзімділік беру үшін CRISPR/Cas13 генді өңдеу жүйесін әзірлеу» тапсырмасының негізі болып, гранттық қаржыландыру алуға мүмкіндік берді. Диссертацияның қорғауға ұсынылатын негізгі қағидалары. 1. Жабайы типті TBSV вирусы мен оның мутанттарына бағытталған Cas13 және crРНҚ құрылымдары N. benthamiana-да экспрессиялану үшін in silico дизайн жасалынды, pK2GW7-pCas13a құрылымдары транзиентті түрде экспрессияланды. TBSV вирусының P19 ақуызына арнайы бағытталған crРНҚ құру кезінде Tombusvirus тұқымдасына жататын барлық вирустарға қарсы күресуде CRISPR/Cas13 жүйесін әмбебап қолдану перспективасы қарастырылды. 2. Вирустың жинақталуының индикаторы ретінде GFP сигналдарын және вирус бөлшектерінің титрінің индикаторы ретінде P19 ақуызының экспрессиясын пайдалана отырып, TBSV және оның мутанттарына қарсы молекулалық интерференциясы зерттелінді. Барлық crРНҚ бақылау элементтерімен салыстырғанда ультракүлгін сәулесінің астында инокуляцияланған жапырақтарда GFP экспрессия деңгейлерінің төмендегенін көрсетті. Сонымен қатар, GFP-бағытталған crРНҚ-ларда GFP сигналының төмен, бірақ анықталатын деңгейлері табылды, ал төмендеудің жоғары деңгейі P19-ға бағытталған crРНҚ-ларда байқалды. Басқа нысандармен салыстырғанда TBSV геномының P19 реттілігіне комплементарлы crРНҚ-ны жақсырақ нысанаға алу әлеуеті вирус геномындағы P19-ның қожайын РНҚ-интерференция қорғаныштық механизмінің супрессоры ретіндегі қызметімен байланысты. Р19 деңгейлерінің кез келген мөлшерге тәуелді өзгеруі TBSV мутанттарында көрсетілгендей, өсімдік жасушасында вирустың таралуына және қиРНҚ-P19 кешендерінің түзілуіне әсер етуі мүмкін. Екінші жағынан, бейспецификалық nsgcrРНҚ бақылауында және жабайы түрмен инокуляцияланған N. benthamiana өсімдіктерінде жоғары GFP сигналдары байқалды, бұл вирустық кедергіге арналған CRISPR/pCas13a жүйесінің тиімділігін растайды. 3. Вирустық РНҚ-ға CRISPR/Cas13 жүйесінің бағытталу тиімділігі әр түрлі crРНҚ-GFP мен crРНҚ-Р19 реттіліктері арасындағы ерекшеліктері зерттелінді. Басқа нысандармен салыстырғанда TBSV P19 реттілігіне комплементарлы crРНҚ RMJ1 мутантындағы GFP-ге бағытталған crРНҚ қарағанда тиімділігі жоғарырақ екендігі анықталды. 4. Р19 супрессорлық ақуызының биологиялық контексте өсімдік miR функциясына өзара әрекеттесуі зерттелді. Р19 ақуызының miR 168 және 162 экспрессиясына дифференциалды әсері ерте вирустық инфекция кезінде ең үлкен екенін көрсетті. Нәтижелер P19-ның өсімдік miR функцияларына әсері симптомдардың дамуына емес, өсімдіктердің вирусқа қарсы реакцияларына әсер ететіндігін көрсетті. Осы микроРНҚ-лардың екеуінің экспрессиясы жабайы типтегі TBSV-ге қарсы бағытталған CRISPR/Cas13a жүйесінің бар кезінде де анықталды. 5. Векторлардың тиімділігін арттыру мақсатында РНҚ-интерференцияның супрессоры – Р19 ақуызының бағытталған ко-трансформациясының мақсатты геннің көп жинақталуына әсері зерттелді. Алынған деректер негізінде өсімдік РНҚ-интерференция мен CRISPR/Cas13 жүйесі арасындағы функционалдық өзара әрекеттестіктің жұмыс моделі құрылды. Өсімдіктердегі CRISPR/Cas13 жүйесінің реттелуінің модуляторы ретінде Р19 ақуызының рөлі зерттелді. 6. Өсімдік температурасының модуляциясын қолдана отырып, CRISPR/Cas жүйесінің тиімділігін арттыру үшін жаңа әдістеме әзірленді. Алынған нәтижелер негізінде pCas13a ақуыздың жоғарылаған экспрессиясын алу үшін 370С ең оңтайлы температура екені анықталды. Автордың жеке үлесі. Ғылыми зерттеумен байланысты әдебиетке шолу, диссертацияның мақсаты мен міндеттерін анықтау, тәжірибелік жұмыстарды жасау, зерттеу нәтижелерін талқылап, статистикалық анализдер жүргізу, докторлық диссертацияны жазу, талаптарға сай рәсімдеу мен алынған зерттеу нәтижелерін Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің «Өсімдіктер биотехнологиясы» мамандығының студенттерінің оқу процесіне ендірілуі автордың жеке қатысуымен орындалды. Диссертациялық жұмыс барысында интеллектуалдық адалдықтың жоғары стандарттары және ғылыми деректерді қолдан жасаудың, бұрмалаудың, плагиаттың және жалған бірлескен авторлықтың алдын алуы жасалды. Жұмыстың ғылыми-зерттеу бағдарламаларымен байланысы. Диссертациялық жұмыс ҚР БҒМ 2021-2023 жж. АР09258746 «Өсімдіктерге вирусқа қарсы төзімділікті күшейту мақсатында вирустық ақуыз көмегімен CRISPR/Cas13 жүйесінің реттелуі» гранттық қаржыландыру шеңберінде Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің Рустем Тукенұлы Омаров атындағы өсімдіктер биотехнологиясының ғылыми зертханасы (Қазақстан, Астана) мен Тарас Шевченко атындағы ұлттық университетінің вирусология департаменті, «Биология және медицина» ғылыми-зерттеу институтында (Украина, Киев) орындалды. Сонымен қатар, диссертациялық жұмыста қолданылған әдістер Бен-Гурион университеті (Израиль, Негев) мен Силезия университетінде (Польша, Катовице) оңтайландырылды. Зерттеу нәтижелерінің апробациясы. Зерттеу нәтижелері мен диссертацияның негізгі ережелері халықаралық және республикалық конференцияларда баяндалды және ұсынылды: - «Bioresources and Viruses» X халықаралық конференция, 2023, Киев, Украина; - «Микробиология, биотехнология және биоәртүрліліктің өзекті мәселелері» халықаралық ғылыми-практикалық конференциясы, 2022, Астана, Қазақстан; - «ǴYLYM JÁNE BILIM - 2022» студенттер мен жас ғалымдардың XVII халықаралық ғылыми конференциясы Астана, Қазақстан; - «Азия далаларының биологиялық әртүрлілігі» IV халықаралық ғылыми конференция, 2022, Астана; Қазақстан; - «XXI ҒАСЫР БИОЛОГИЯСЫ ЖӘНЕ БИОТЕХНОЛОГИЯСЫ -2021 ж.» Жас ғалымдардың халықаралық ғылыми форумы, 2022, Астана, Қазақстан; - «TENDENZE ATTUALI DELLA MODERNA RICERCA SCIENTIFICA», халықаралық ғылыми-практикалық конференция, 2020, Штутгарт, Германия; - II халықаралық ғылыми-практикалық конференция, 2020, Екатеринбург, Ресей федерациясы. Мақалалар. Ұсынылған диссертация 19 баспа мақалаларында, соның ішінде 1 мақала (Q3) мен 1 тезис (Q2) Web of Science және Scopus деректер базасына кіретін нөлден жоғары импакт-факторы бар журналдарда, Қазақстан Республикасының ғылым және жоғары білім министрлігінің білім саласында сапаны қамтамасыз ету комитетімен ұсынылған 4 мақала мен халықаралық ғылыми конференцияларда 12 тезис пен мақалаларда және 1 патентте көрсетілген. Диссертацияның көлемі мен құрылымы. Диссертация 96 бетте сипатталған және анықтамалар мен қысқартулардан, кіріспе, әдебиетке шолу, материалдар мен әдістерден, зерттеу нәтижелері мен талқылаудан, қорытынды, 120 пайдаланылған әдебиеттері тізімінен, 9 кесте мен 59 суреттен тұрады. Алғыс. Бұл диссертациялық жұмысты ардақты ұстазымыз, профессор Рүстем Омаровтың рухына арнай отырып, білім алуымызға, дамуымызға зор үлес қосқан үлгі тұтарлық тұлғасына алғысымды және құрметімді білдіргім келеді.
Зерттеулерді этикалық бағалау жөніндегі комиссияның қорытындысы