В Евразийском национальном университете имени Л.Н. Гумилева состоится защита диссертации на соискание степени доктора философии (PhD) Камаловой Динары Камаловны на тему «Изучение генетического разнообразия вируса SARS-CoV-2 и сопутствующих вирусных инфекций (энтеровирусов и вируса гриппа A(H1N1)) в Казахстане» по образовательной программе «8D05107 – Биология».
Диссертация выполнена на кафедре «Кафедра Общей биологии и геномики» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева.
Язык защиты - на русском
Официальные рецензенты:
Кушугулова Алмагуль Рахимберлиевна – доктор медицинских наук, руководитель Лаборатории Микробиома Центра наук о жизни, ЧУ «National Laboratory Astana», Назарбаев университет (г. Астана, Казахстан).
Турдалина Баян Рысбековна – PhD, профессор, врач педиатр 1 квалификационной категории, доцент кафедры детских инфекционных болезней. (г. Астана, Казахстан).
Временные члены Диссертационного совета:
Табынов Кайрат Казыбаевич – PhD, ассоциированный профессор, НАО «Казахский национальный аграрный исследовательский университет». (г. Алматы, Казахстан).
Жунусова Гульнур Сагиндыковна – PhD, ассоциированный профессор, ведущий научный сотрудник РГП на ПХВ «Институт Генетики и Физиологии» КН, (г. Алматы, Казахстан).
Охлопкова Олеся Викторовна – кандидат биологических наук, Старший научный сотрудник лабораториимолекулярной вирусологии Научно-исследовательского института гриппа имени А.А. Смородинцева (г.Санкт-Петербург, Россия).
Научные консультанты:
Шевцов Александр Борисович - кандидат биологических наук, ассоциированный профессор, заведующий лабораторией прикладной генетики ТОО «Национальный центр биотехнологии», г. Астана, Республика Казахстан
Филлипенко Максим Леонидович- доктор биологических наук, доцент, заведующий лабораторией фармакогеномики Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук г. Новосибирск, Российская Федерация.
Защита состоится: 10 апреля 2026 года 11:00 часов в Диссертационном совете по направлению подготовки кадров «8D051 – Биологические и смежные науки» по специальности «8D05107 – Биология» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева. Заседания диссертационного совета состоится в офлайн и онлайн формате.
Ссылка: https://us06web.zoom.us/j/84209566920?pwd=Vb3hqH81YkdlgFj3xsbkhAGLokaSLi.1
Идентификатор конференции: 842 0956 6920
Код доступа: 461018
Адрес: г. Астана, ул. Кажымукана, 13, корпус №3, ауд. №333
Аннотация (рус.): Общая характеристика диссертационного исследования. Работа посвящена комплексному исследованию генетического разнообразия вируса SARS-CoV-2 и сопутствующих вирусных инфекций (энтеровирусов и вируса гриппа A(H1N1)) у пациентов в Казахстане в 2021–2023 гг. с применением методов полногеномного секвенирования. Актуальность исследования COVID-19 – острое респираторное заболевание, вызываемое коронавирусом SARS-CoV-2, которое с 2020 года привело к глобальной пандемии, затронувшей миллионы людей. Несмотря на снижение тяжести клинических форм в результате вакцинации и накопления популяционного иммунитета, продолжающаяся циркуляция новых генетических вариантов вируса сохраняет высокий эпидемиологический риск. SARS-CoV-2 обладает высокой мутационной способностью, что приводит к появлению вариантов с изменённой трансмиссивностью, патогенностью и устойчивостью к нейтрализующим антителам. В условиях активной циркуляции SARS-CoV-2 в популяции всё большую значимость приобретают случаи коинфекций с другими вирусами, передающимися воздушно-капельным путём. Наибольшее внимание уделяется гриппу A(H1N1) и энтеровирусам, которые могут усиливать тяжесть клинической картины COVID-19, затруднять диагностику и влиять на исход заболевания. Совместное течение нескольких вирусных инфекций требует своевременного выявления и молекулярного типирования всех возбудителей. Изучение генетического разнообразия SARS-CoV-2, а также мониторинг сопутствующих вирусных инфекций, таких как вирус гриппа A(H1N1) и энтеровирусы, необходимо для понимания эпидемических процессов, оптимизации методов лабораторной диагностики и корректировки клинических протоколов. Особенно актуально это для Казахстана, где ранее отсутствовали системные исследования, основанные на полногеномном секвенировании и мультиплексном вирусологическом анализе. Проведение таких исследований позволит повысить готовность системы здравоохранения к появлению новых патогенов и коинфекционных форм заболеваний. Объект исследования: образцы РНК из назофарингеальных смывов от пациентов с установленным диагнозом COVID-19. Цель исследования Изучение генетического разнообразия вируса SARS-Cov-2 и сопутствующих вирусных инфекций (энтеровирусов и вируса гриппа A(H1N1)) в Казахстане методом полногеномного секвенирования. Задачи исследования: 1. Подбор праймеров для полногеномного секвенирования вируса SARS-CoV-2 с учетом критерия близкой температуры отжига, отсутствия вторичных структур и специфичности к референсной последовательности NC_045512.2 (Wuhan-Hu-1). 2. Разработка протокола обратной транскрипции и мультиплексной амплификации генома SARS-CoV-2. 3. Сбор биологических образцов от пациентов с подозрением на респираторные вирусные инфекции (включая COVID-19, грипп и энтеровирусную инфекцию) с целью комплексной оценки циркулирующих возбудителей и их генетического разнообразия. 4. Проведение полногеномного секвенирования вируса SARS-CoV-2 на платформе Illumina MiSeq. 5. Анализ результатов полногеномного секвенирования SARS-Cov-2 в образах РНК пациентов и выявление ассоциаций с течением болезни. Изучить распространённость и генетическое разнообразие энтеровирусов и вируса гриппа A(H1N1) у пациентов с COVID-19 методом полногеномного секвенирования Методы исследования. Работа выполнена с применением микробиологических, молекулярно-генетических и биоинформатических методов исследования, включая ПЦР, обратную транскрипцию, амплификацию, секвенирование на платформе Illumina MiSeq и анализ с использованием алгоритмов Pangolin и филогенетических подходов. Научная новизна результатов исследования: 1) Разработаны и оптимизированы праймеры и лабораторные протоколы полногеномной амплификации SARS-CoV-2 с получением последовательностей высокого качества (глубина прочтения 3000–5000×). 2) Проведено полногеномное секвенирование 879 образцоы SARS-CoV-2, классифицированных по системе Pangolin, выявлено 34 линии вируса, включая BA.5, B.1.617.2, XBB.1.5 и другие, что позволило изучить динамику смены доминирующих вариантов в Казахстане. 3) Впервые в Казахстане проведено секвенирование 65 геномов энтеровирусов у пациентов с COVID-19, установлено наличие 8 серовариантов (CVA9, CVB3, CVB5, E6, E9, E11, E21, E25) на основе анализа полной последовательности VP1. 4) Включены данные о полном геноме вируса гриппа A(H1N1)pdm09 (A/Kazakhstan/5757/2022), относящегося к кладе 6B.1A.5a.2, что впервые документирует циркуляцию данного варианта на территории Казахстана. 5) Установлено, что присутствие сопутствующих вирусов (энтеровирусов, A(H1N1), EBV и др.) влияет на особенности SARS-CoV-2-ассоциированной инфекции, повышая вероятность осложнённых и атипичных проявлений у детей. Теоретическая и практическая значимость работы: 1. Проведен подбор праймеров для полногеномного секвенирования вируса SARS-CoV-2, подобрано 39 пар праймеров, которые разбили геном на 39 участков с областью перекрытия не менее 100 п.н.; Полученные данные использованы для создания универсальной панели амплификации, пригодной для диагностики и мониторинга вариантов вируса в популяции. 2. Разработан протокол обратной транскрипции и мультиплексной амплификации генома. С использованием данных праймеров были оптимизированы условия постановки ПЦР и разработан протокол полногеномной амплификации вируса SARS-CoV-2 с использованием 3 мультиплексных реакций и одношаговой ОТ- ПЦР; Разработанный протокол позволяет применять его для геномного надзора и идентификации новых генетических вариантов респираторных вирусов; 3. В рамках работы сформирована коллекция РНК из 994 охарактеризованных образцов от пациентов, представляющих все регионы Республики Казахстан, в том числе группу детей в возрасте до 16 лет из инфекционной больницы г. Астана. Дополнительно в рамках мониторинга сопутствующих вирусных инфекций были отобраны биологические пробы от пациентов с подозрением на коинфекции, вызванные энтеровирусами и вирусом гриппа A(H1N1), с целью оценки их возможной связи с клиническим течением COVID-19. Проведено полногеномное секвенирование вируса SARS-CoV-2 на платформе Illumina MiSeq. В период с 2021 по 2023 годы выполнено 881 полногеномное секвенирование при плановом объёме 300 образцов, что позволило значительно расширить генетическую базу данных по SARS-CoV-2, циркулировавшему на территории Казахстана. 4. Проведен анализ результатов полногеномного секвенирования в образцах РНК пациентов и выявление ассоциаций с течением болезни, периодом заражения, а также эффективностью лечения в зависимости от генотипа вируса. На основании классификации Pangoline 879 полученная последовательность была разделена на 34 линии, большая часть из которых относится к вариантам Альфа, Дельта и Омикрон. Наиболее часто в Казахстане циркулировала линия ВА.5 варианта Омикрон (12,3%) и линия B.1.167.122 варианта Дельта (11,2%),которые в течение пандемии COVID-19 наиболее часто циркулировали во всем мире. Затем по частоте циркуляции находились линии ХВВ.1.5 (8,88%); ХВВ 1.9 (8,66%); ВА.1 (7,97%); В.1.617.2 (6,95%); В.1.1 (5,69%); АY.16 (4,56%); ВQ.1 (3,64%); ХВВ (3,64%); В.4.1 (2,85%); А.2 (2,28%); В.1.1.529 (2,16%). Намного реже циркулировали в Казахстане линий СН.1.1 (1,37%); В.1.1.7 (1,14%); В.1.617.2 (0,57%); В. (0,34%); В.1.1.189 (0,23%); В.1.1.294 (0,23%); В.1.617.2.127 (0,23%); В.А.4 (0,23%); АY.122 (0,11%); В.А.5.8 (0,11%); В.1.1.10 (0,11%); В.1.1.174 (0,11%); В.1.1.177.53 (0,11%); В.1.1.617.2.121 (0,11%); ВА.5.2 (0,11%) и ВА.5.8 (0,11%). Особенности проявлений SARS-CoV-2-инфекции во многом определялись генетическим вариантом вируса. Так, при инфицировании вариантом Delta респираторные признаки, такие как кашель и лихорадка, сохраняли доминирующее значение, тогда как частота желудочно-кишечных симптомов заметно снижалась. Кроме того, для дельта-варианта было характерно более частое появление боли в горле, что ранее практически не отмечалось у пациентов, инфицированных исходным (дикотипным) вариантом вируса. Инфекция, связанная с вариантом Omicron, характеризовалась более мягкими проявлениями по сравнению с дельта-вариантом, что, в частности, связано с меньшей вероятностью развития поражения нижних дыхательных путей. Проведённый анализ показал, что у части детей наблюдались атипичные проявления SARS-CoV-2-инфекции, формировавшиеся на фоне сопутствующих вирусных коинфекций (вирус Эпштейна–Барр, ветряная оспы, ротавирус). Такие сочетания сопровождались кожными изменениями и выраженными гастроинтестинальными нарушениями, что отражает модифицирующее влияние дополнительных вирусных агентов на спектр проявлений SARS-CoV-2-инфекции. 5. В рамках выполнения научной работы проведено полногеномное секвенирование 65 геномов энтеровирусов, выделенных у пациентов в период сезонного подъёма вирусных инфекций в 2022 году. В результате установлено восемь основных серовариантов (Сoxsackievirus A9, Coxsackievirus B3, Coxsackievirus B5, Echovirus 6, Echovirus 9, Echovirus 11, Echovirus 21 и Echovirus 25), а также впервые описано генетическое разнообразие вирусов, циркулировавших в Казахстане. Дополнительно в осенний период 2022 года впервые в Казахстане было секвенировано полный геном вируса гриппа A(H1N1)pdm09 (A/Kazakhstan/5757/2022), относящегося к кладе 6B.1A.5a.2, характерной для мировой циркуляции 2022 года. Полученные данные позволяют использовать результаты полногеномного секвенирования не только для мониторинга SARS-CoV-2, но и для сопутствующих вирусных инфекций, что расширяет практическое значение исследования для эпидемиологического надзора и молекулярной диагностики; Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Проведен подбор праймеров для полногеномного секвенирования вируса SARS-CoV-2, подобрано 39 пар праймеров, которые разбили геном на 39 участков с областью перекрытия не менее 100 п.н. 2. Разработан и оптимизирован лабораторный протокол полногеномной амплификации SARS-CoV-2, включающий подбор специфичных пар праймеров, методы обратной транскрипции и мультиплексной амплификации, обеспечивающий получение высококачественных библиотек для секвенирования и возможность адаптации протокола для анализа других респираторных вирусов. 3. Проведено полногеномное секвенирование 881 образцов SARS-CoV-2, отобранных на территории Республики Казахстан в 2021–2023 гг., с применением платформы Illumina MiSeq и последующим биоинформатическим анализом, что позволило получить репрезентативную картину эволюции вируса в популяции. 4. Установлено генетическое разнообразие SARS-CoV-2, циркулировавшего в популяции Казахстана, с идентификацией 34 генетических линий, включая BA.5, B.1.617.2, XBB.1.5 и другие, что подтверждает активную вирусную эволюцию и смену доминирующих вариантов во времени. 5. Показана ассоциация между генотипом вируса SARS-CoV-2 и особенностями SARS-CoV-2-ассоциированной инфекции, включая наличие сопутствующих вирусных агентов (энтеровирусов, A(H1N1), EBV, ротавируса, ветряная оспа), что подчёркивает важность генотипирования при интерпретации результатов молекулярно-эпидемиологических исследований. 6. Впервые в Казахстане проведено полногеномное секвенирование энтеровирусов, выделенных у пациентов с COVID-19 и в период сезонного подъёма вирусных инфекций, с построением минимальных остовных филогенетических деревьев и идентификацией восьми серотипов (Coxsackievirus A9, Coxsackievirus B3, Coxsackievirus B5, Echovirus 6, Echovirus 9, Echovirus 11, Echovirus 21, Echovirus 25), что позволило определить генетическую структуру циркулирующих штаммов и их возможную связь с клиническими проявлениями заболевания. 7. Впервые описан полный геном вируса гриппа A(H1N1)pdm09 (A/Kazakhstan/5757/2022), секвенированный в Казахстане, относящийся к кладе 6B.1A.5a.2, что подтверждает значимость включения вируса гриппа в систему рутинного молекулярного надзора в сочетании с SARS-CoV-2. Основные результаты исследований и выводы: 1. Были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать весь геном фрагментами от 1200 до 1600 п.н с перекрытием не менее 100 п.н. 2. Разработан и оптимизирован лабораторный протокол полногеномной амплификации SARS-CoV-2, включающий подбор специфичных пар праймеров, методы обратной транскрипции и мультиплексной амплификации, который обеспечивает равномерное покрытие всего генома вируса SARS-CoV-2 c глубиной прочтения от 3000 до 5000. 3. Проведён сбор биологических образцов от пациентов с подозрением на респираторные вирусные инфекции (включая COVID-19, грипп и энтеровирусную инфекцию) с целью комплексной оценки циркулирующих возбудителей и их генетического разнообразия. В рамках работы сформирована коллекция из 994 охарактеризованных образцов от пациентов, представляющих все регионы Республики Казахстан, в том числе группу детей в возрасте до 16 лет из инфекционной больницы г. Астана. Дополнительно в рамках мониторинга сопутствующих вирусных инфекций были отобраны биологические пробы от пациентов с подозрением на коинфекции, вызванные энтеровирусами и вирусом гриппа A(H1N1), с целью оценки их возможной связи с клиническим течением COVID-19. 4. Оптимизирован протокол полногеномного секвенирования и проведено полногеномное секвенирование 881 образцов вируса SARS-CoV-2. Получены новые данные о генетических изменениях вируса SARS-CoV-2 и полногеномные данные вируса SARS-CoV-2 в Казахстане в период с 2021 по 2023 годы. 5. Определено генетического разнообразия циркулировавших на территории Казахстана вирусов SARS CoV-2 в период 2021-2023 годов, а также в изучении динамики изменения доминирующих генотипов. Впервые в Казахстане описаны клинические случаи COVID-19 у детей, осложнённые сопутствующими вирусными инфекциями (вирус Эпштейна–Барр, ветряная оспа, ротавирус), а также проведён молекулярно-генетический анализ энтеровирусов и вируса гриппа A(H1N1). Связь диссертации с госпрограммами. Исследования проводились в рамках программы грантового финансирования научных и (или) научно-технических проектов Комитета науки МОН РК на 2021-2023 годы: AP09260668 «Изучение генетического разнообразия вируса SARS-COV-2 в Казахстане». Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были апробированы и представлены на следующих научных мероприятиях: – 3-й международной научно-практической конференции «Современная фармация: новые подходы в образовании и актуальные исследования», посвящённой 70-летнему юбилею Лауреата Государственной премии Республики Казахстан, доктора фармацевтических наук, профессора Арыстановой Танагуль Акимбаевны. Представлена устная презентация на тему: «Clinical characteristics of omicron BA.5 variant in children in Kazakhstan (2022–2023)» (Астана, 2023); – международном симпозиуме «Единое здоровье – взгляд в будущее», организованном Национальным научным центром особо опасных инфекций имени Масгута Айкимбаева совместно с Германским обществом по международному сотрудничеству (GIZ) и Институтом микробиологии Бундесвера (IMB). Представлены тезисы на тему: «Разработка протокола обратной транскрипции и мультиплексной амплификации генома вируса SARS-CoV-2» (Алматы, 27 октября 2022 г.). Публикация результатов исследования. По материалам диссертационной работы опубликованы научные статьи и разработаны методические рекомендации, в том числе в изданиях, рекомендованных Комитетом по контролю в сфере образования и науки Министерства образования и науки Республики Казахстан: 1. Co-infection with COVID-19 and genetic diversity of SARS-CoV-2 in children // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. – 2023. – №3. – С. 15-22. 2. Development of a protocol for whole genome sequencing of the SARS-CoV-2 virus // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2022. – Т. 92, №3. – С. 101-108. 3. Полногеномное секвенирование вируса SARS-CoV-2, вызывающего инфекцию COVID-19: методические рекомендации (Алматы: АО «Институт топлива, катализа и электрохимии им. Д.В. Соколовского», 2023. – 28 с.). 4. Genetic Diversity of Human Enterovirus in Kazakhstan, during 2022 // International Journal of Microbiology. – 2024. – №1. – С. 7796913). 5. Complete genome sequence of a human influenza A virus (H1N1) detected in Kazakhstan in the fall of 2022 // Microbiology Resource Announcements. – 2025. – Vol. 14, №1. – P. e01040-24 (Q4). 6. Разработан протокол обратной транскрипции и мультиплексной амплификации генома SARS-CoV-2 в пределах 8 реакций. 7. Разработан протокол полногеномной амплификации вируса SARS-CoV-2. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах компьютерного текста и включает обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, заключение, список использованных источников, 5 приложений. Список использованных источников состоит из 274 наименований отечественных и зарубежных авторов. Работа содержит 7 таблиц, 18 рисунок.
Отзыв зарубежного консультанта
Заключение комиссии по этической оценке исследований
Решение диссертационного совета
Защита диссертации: https://youtu.be/AzxnxtUUrWw?si=AkT2Y3_LFXqps0Pd
