В Евразийском национальном университете имени Л.Н. Гумилева состоится защита диссертации на соискание степени доктора философии (PhD) Акишева Жигера Дастановича на тему «Структура и функции химозинов Camelus bactrianus и Bos taurus» по специальности «6D060700 – Биология».
Диссертация выполнена на кафедре «Кафедра Общей биологии и геномики» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева.
Язык защиты - на русском
Официальные рецензенты:
Рожкова Александра Михайловна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской Академии Наук (г. Москва, Российская Федерация).
Жигайлов Андрей Викторович – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией белка и нуклеиновых кислот РГП «Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина» (г.Алматы, Республика Казахстан).
Временные члены Диссертационного совета:
Шайхин Серик Мурзахметович – доктор биологических наук, заведующий лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов Республиканской коллекции микроорганизмов (г. Астана, Республика Казахстан).
Гончарова Алла Владимировна – кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии, биохимии, физиологии растений Казахский национальный университет им. аль-Фараби (г. Алматы, Республика Казахстан).
Кушугулова Алмагуль Рахимберлиевна – доктор медицинских наук, руководитель Лаборатории Микробиома Центра наук о жизни, ЧУ Национальная лаборатория Астаны, Назарбаев Университет (г. Астана, Республика Казахстан).
Научные консультанты:
Хасенов Бекболат Бауржанович – кандидат химических наук, профессор по специальности биологические науки, заведующий лабораторией генетики и биохимии микроорганизмов ТОО «Национальный центр биотехнологии» (г. Астана, Республика Казахстан).
Сапарбаев Мурат Калиевич – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией «Репарация ДНК» Института Густава Русси (г.Вильжуиф, Франция).
Защита состоится: 25 февраля 2025 года 12:00 часов в Диссертационном совете по направлению подготовки кадров «8D051 – Биологические и смежные науки» по специальности «6D060700 – Биология» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева. Заседание диссертационного совета пройдет в смешанном формате (в оффлайн и онлайн формате на платформе Microsoft Teams).
Ссылка: https://clck.ru/3FkLBB
Адрес: 010008, г. Астана, ул. Кажымукана, 13, корпус №3, ауд. №333
Аннотация (рус.): Общая характеристика работы Диссертационная работа посвящена изучению биохимических свойств рекомбинантных химозинов из Bos taurus и Camelus bactrianus. Актуальность темы Протеолиз — это расщепление белков и пептидов на более мелкие пептиды или аминокислоты, которое происходит путем гидролиза пептидной связи ферментами, называемыми протеолитическими ферментами, протеиназами, протеазами или пептидазами. Аспарагиновые протеазы, являющиеся основным объектом данной работы, широко распространены в природе; они встречаются у млекопитающих, птиц, рыб, растений, грибов, бактерий и вирусов. Широкий спектр функций, выполняемых аспарагиновыми протеазами в живой природе, является причиной их интенсивного изучения и использования в различных отраслях хозяйственной деятельности. Молоко и продукты его переработки относятся к основным источникам питания человека со времен неолитической революции. В 2023 году мировое производство молока в мире составило 965 млн. тонн, что на 18% выше, чем в 2016 году, и более чем на 70% больше, чем в 2000 году. Основным видом молока является молоко крупного рогатого скота. Доля совокупного производства коровьего и буйволиного молока остается более или менее постоянной на уровне 96% (коровье и буйволиное молоко составляли 81% и 15,2% от мирового производства молока). В 2021 году на долю козьего, овечьего и верблюжьего молока приходилось 2,3%, 1,2% и 0,4% мирового производства. Это молоко играет важную роль в сельском хозяйстве регионов Средиземноморья, Передней и Юго-Восточной Азии. Оленье, ослиное и кобылье молоко широко не потребляется, однако такое молоко имеет большое культурное значение для отдельных наций и этносов. Несмотря на доминирующее положение молока от КРС, в последнее время другие типы молока находятся в центре внимания обширных исследований из-за их потенциальной пользы для здоровья и возможности использования в составе детских смесей вследствие их гипоаллергенности. В настоящее время в процессе производства сыра для сворачивания молока используются коагулянты животного, растительного и микробного происхождения, но традиционно в сыродельном производстве используют сычужный фермент, продуцируемый железистыми клетками четвертого отдела желудка жвачных животных (сычуга). В наибольших количествах сычужный фермент образуется в начальный молочный период жизни телят, козлят и ягнят, поэтому для получения сычужного фермента используют сычуги только молодых животных (от 3-10 дней). Сычужный фермент представляет собой смесь двух эндопептидаз: пепсина и химозина известного также как ренин. В составе ренина химозин варьируется от 10% до 90%, препарат, в котором превалирует или содержится только химозин, представляет собой наибольшую ценность в сыроварении, так как его состав сильно влияет на органолептические и вкусовые качества сыра. Первоначально, химозин секретируется в инактивированной форме – прохимозина и затем путем автокаталитического протеолиза при низком значении рН активируется в белок химозин с молекулярной массой 36 кДа. После активации фермент разрушает белок казеин в специфической точке и способствует сворачиванию молока. Фермент гидролизует связь между Phe105 и Met106 в молекуле капа-казеина, что ведет к дестабилизации казеинового мицелия и образованию сгустка. Ограничивающим фактором в мировом увеличении продукции сыра связано с уменьшением количества забиваемых животных, что стимулирует исследования для поиска альтернативных источников химозина. На практике используют химозин грибного и растительного происхождения, но ценность их в сыроварении невысока. Альтернативным источником более ценного химозина животного происхождения является использование технологии рекомбинантных ДНК для получения фермента. Для продукции химозина в грибах используют нитчатые грибы Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Trichoderma reesei, но более перспективным способом является получение химозина в дрожжах. Наиболее эффективным является экспрессионная система на основе Pichia (Komagataella) pastoris, которая производит относительно низкий уровень собственных секретируемых белков, что значительно облегчает очистку рекомбинантного белка и, благодаря которой, на рынок был выведен широкий спектр белковых продуктов терапевтического и промышленного применения. Наряду с известными и используемыми молоко-свертывающими ферментами осуществляются поиск новых ферментов, в качестве которых можно использовать растительный аналог пепсина из артишока испанского (Cynara cardunculus), химозин яка (Bos mutus) или бизона (Bison bison) или химозин одногорбого верблюда Camel dromedarius. Конечно, реннин микробиального происхождения более дешев чем, химозины животного происхождения, однако текстура и органолептические свойства сыра, полученного при использовании реннина из Rhizomucor miehei уступают сырам, полученным при использовании верблюжьего химозина, который можно получать не только в дрожжах, но и в клетках гриба Aspergillus niger. Предлагаемая работа находится на стыке молекулярной биологии, энзимологии, биохимии, промышленной и пищевой биотехнологии. Молекулярно-биохимическая часть будет посвящена получению и изучению двух рекомбинантных химозинов парнокопытных семейств верблюдовых и полорогих, геномы которых известны на сегодняшний день: Camelus bactrianus и Bos taurus, с использованием современного арсенала методов молекулярной биологии и биохимии: биоинформатического анализа, сборки генов de novo, сайт-направленный мутагенез, многоуровневая система скрининга с применением методов протеомики и биохимические методы анализа. Биотехнологическая часть диссертационной работы включает в себя использование метода микробного синтеза целевого химозина методом глубинной ферментации в биореакторе. Использование рекомбинантного химозина в сыроварении и получении творога представляет собой применение рекомбинантных химозинов в пищевой биотехнологии. Научная новизна и теоретическая значимость работы Впервые была клонирована нуклеотидная последовательность гена прохимозина Б Camelus bactrianus. На основе экспрессионных векторов pET28c(+), pGAPZαA и pPICZαA были впервые созданы плазмидные конструкции, включающие в себя нуклеотидные последовательности генов прохимозина Б парнокопытных B. taurus и C. bactrianus. Впервые проведено изучение биохимических свойств рекомбинантных телячьего и верблюжьего химозинов, включая определение специфической и общей протеолитической активности ферментов. Впервые изучена молоко-свертывающая активность на различных типах молока. Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение биохимических характеристик рекомбинантных химозинов Camelus bactrianus и Bos taurus с определением автокаталитической, протеолитической и коагуляционной активностей. Для достижения данной цели решались следующие задачи: 1. Расчет in silico и синтез полноразмерных генов препрохимозина Б из Camelus bactrianus и Bos taurus. Клонирование гена телячьего препрохимозина Б в составе бактериального вектора, внутриклеточная экспрессия в клетках Escherichia coli и очистка рекомбинантного белка при помощи аффинной хроматографии. Получение поликлональных антител против химозина Б. 2. Клонирование генов телячьего и верблюжьего прохимозина Б в составе дрожжевых векторов, получение рекомбинантных белков секреторным способом в Pichia pastoris и их очистка ионно-обменной хроматографией. 3. Изучение биохимических параметров специфической молоко-свертывающей и общей протеолитической активности, и определение субстратной специфичности рекомбинантных химозинов из Camelus bactrianus и Bos taurus. 4. Получение рекомбинантных химозинов из Bos taurus и Camelus bactrianus методом глубинной ферментации в биореакторе и проведение тестовых испытаний по коагуляции различных типов молока. 5. Разработка количественного метода по определению биохимических и кинетических параметров аспарагиновых пепсиноподобных протеаз. Объекты исследования: аспарагиновые протеазы химозин Б из Bos taurus и из Camelus bactrianus. Предмет исследования: биохимические свойства телячьего и верблюжьего химозинов. Методы исследования: методы микробиологии, молекулярной биологии, биохимии, генетической инженерии, биотехнологии. Практическая значимость работы. Созданы рекомбинантные штаммы - продуценты способные к секреции молоко-свертывающих ферментов. Получены рекомбинантные аналоги химозинов теленка и двугорбого верблюда, обладающие комплексом технологических свойств привлекательных для сыроделия. Ферменты представляют интерес для предприятий по переработке молока. Разработана технология получения биопрепарата, востребованного в сыроделии с возможностью применения в комплексной переработке молока с получением конкретных и востребованных продуктов. Основные положения, выносимые на защиту: На защиту выносятся следующие результаты научной деятельности 1. Культивирование штаммов Pichia pastoris, продуцирующих рекомбинантный химозин, в среде содержащей: 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ цитрат-фосфатный буфер (рН 4,0), 10 мМ аскорбиновую кислоту, 5% сорбитол, 1% свекловичную мелассу и 4% глюкозы позволяет получить до 20 мг с литра культуры фермента, обладающего молоко-свертывающей активностью. 2. Рекомбинантные химозины теленка B. taurus и двугорбого верблюда C. bactrianus, полученные в эукариотической системе экспрессии, являются кислыми аспарагиновыми протеазами с максимальной активностью при рН 4,5 и температуре 0-55℃. Химозины являются металлзависимыми ферментами, активность которых увеличивается в присутствии ионов кальция с максимальной активностью при 30-40 мМ CaCl2 и ингибируется ионами никеля до 80 и 100% для верблюжьего и телячьего химозинов, соответственно. 3. Рекомбинантный химозин двугорбого верблюда обладает более высокой молоко-свертывающей активностью на 29%, 46%, 40% и 31% для коровьего, козьего, овечьего и верблюжьего молока, соответственно, чем активность телячьего химозина. На кобыльем молоке специфическая активность верблюжьего химозина в 15 раз превышает активность телячьего химозина. 4. Рекомбинантный верблюжий химозин, является более высокой специфичной молоко-свертывающей протеазой, чем телячий химозин, так как отношение специфической молоко-свертывающей активности к общей протеолитической активности у верблюжьего химозина в 8,3 раза превышает аналогичный показатель телячьего химозина. 5. Метод, основанный на использовании клонированного фрагмента κ-казеина с биотинилированной меткой позволяет качественно и количественно определить активность пепсиноподобных протеиназ. Апробация работы. Основные положения, результаты, выводы и заключение диссертации изложены в 12 печатных работах, в том числе: 1 статья в зарубежном научном журнале «Biology (MDPI)», входящего в базы данных Thomson Reuters, Scopus и входящего в 1-ый квартиль по импакт-фактору в базе Web of Science; 1 статья в зарубежном научном журнале «Heliyon», входящего в базы данных Thomson Reuters, Scopus и входящего во 2-ой квартиль по импакт-фактору в базе Web of Science; 6 статей в республиканских научных журналах, рекомендованных Комитетом по обеспечению качества в сфере науки и высшего образования Министерства науки и высшего образования Республики Казахстан; 1 доклад в материалах международной конференции «European Biotechnology Congress -2017» (Дубровник, Хорватия, 2017), опубликованного в журнале «Journal of Biotechnology», входящего во 2-ой квартиль по импакт-фактору в базе Web of Science; 1 доклад в материалах Международной конференции «Микробные Биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, Белоруссия, 2017); 1 доклад в материалах международной конференции «European Biotechnology Congress-2018» (Афины, Греция, 2018), опубликованного в журнале «Journal of Biotechnology», входящего во 2-ой квартиль по импакт-фактору в базе Web of Science; 1 доклад в материалах Международной конференции «Астана Биотех-2018» (Астана, Казахстан, 2018). На результаты практической работы диссертанта получено 2 Патента Республики Казахстан. Связь работы с программой научных исследований. Данная работа была направлена на получение и изучение биохимических свойств рекомбинантных химозинов из Bos taurus и из Camelus bactrianus. Работа проводилась в лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью «Национальный центр биотехнологии». Диссертационная работа выполнялась в рамках проектов 5134/ГФ «Получение генно-инженерных ферментных препаратов химозина и β-галактозидазы для глубокой переработки молока», АР05133470 «Создание штамма-продуцента и разработка технологии получения рекомбинантного верблюжьего сычужного фермента, востребованного на предприятиях молочной промышленности» и Научно-технической программы BR10764998 «Разработка технологий с использованием новых штаммов полезных микроорганизмов, ферментов, нутриентов и других комплектов при производстве специальных диетических продуктов питания». Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах, содержит 16 таблиц, 63 рисунка, 3 приложения. Список цитируемых источников включает 360 ссылок. Структурно диссертация состоит из перечня принятых в диссертации определений, обозначений и сокращений, введения, три главы, включающих обзор литературных данных, материалы и методы проведения экспериментов, результаты собственных исследований, заключения, списка использованных источников и приложения.
Отзыв зарубежного консультанта
Заключение комиссии по этической оценке исследований
Решение диссертационного совета
Защита диссертации: https://youtu.be/GjcuPa5QTTM?si=DGNojhiyWl9UzwLJ
