В Евразийском национальном университете имени Л.Н. Гумилева состоится защита диссертации на соискание степени доктора философии (PhD) Актаевой Сании Айдарбековны на тему «Выделение и изучение биохимических характеристик протеолитических ферментов из Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis» по специальности «6D060700 – Биология».
Диссертация выполнена на кафедре «Кафедра Общей биологии и геномики» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева.
Язык защиты - на русском
Официальные рецензенты:
Зоров Иван Никитич – кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской Академии Наук (г. Москва, Российская Федерация);
Ли Константин Григорьевич – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Исследовательского парка биотехнологии и экомониторинга Карагандинского государственного университета имени академика Е.А.Букетова (г. Караганда, Республика Казахстан).
Временные члены Диссертационного совета:
Бисенбаев Амангельды Куанбаевич – доктор биологических наук, профессор, директор Научно-исследовательского института проблем биологии и биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби (г. Алматы, Республика Казахстан).
Кожахметов Самат Серикович – кандидат биологических наук, ассоциированный профессор, ведущий научный сотрудник Лаборатории микробиома Центра наук о жизни ЧУ National Laboratory Astana автономной организации образования «Назарбаев Университет» (г. Астана, Республика Казахстан).
Чулкин Андрей Михайлович – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» (г. Москва, Российская Федерация).
Научные консультанты:
Хасенов Бекболат Бауржанович – кандидат химических наук, профессор по специальности биологические науки, заведующий лабораторией генетики и биохимии микроорганизмов ТОО «Национальный центр биотехнологии» (г. Астана, Республика Казахстан);
Сапарбаев Мурат Калиевич – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией «Репарация ДНК» Института Густава Русси (г. Вильжуиф, Франция).
Защита состоится: 12 марта 2025 года 12:00 часов в Диссертационном совете по направлению подготовки кадров «8D051 – Биологические и смежные науки» по специальности «6D060700 – Биология» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева. Проведение заседания диссертационного совета в смешанном (оффлайн и онлайн) формате.
Ссылка: https://clck.ru/3G6KFu
Адрес: г. Астана, ул. Кажымукана, 13, корпус №3, ауд. №333.
Аннотация (рус.): Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена изучению протеолитических ферментов, секретируемых бактериями Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis. Актуальность темы. Протеолитические ферменты или протеазы являются ферментами, гидролизующими белки по пептидным связям, и классифицируются на семейства сериновых, цистеиновых, аспартатных и металлопротеаз. Протеазы встречаются во всех живых организмах: микроорганизмах, животных и растениях, но в промышленной биотехнологии большую часть ферментов получают микробным синтезом. Среди микробиальных источников протеаз перспективными представляются бактерии Bacillus с высокой способностью к секреции протеаз активных как в нейтральном, так и в щелочном значениях рН. Штаммы-продуценты бациллярных протеаз способны расти на недорогих питательных средах, что имеет немаловажное значение, так как стоимость компонентов среды может определять до 40% стоимости самого фермента. Для промышленной продукции микробиальных протеаз в биореакторах используют методы глубинной и твердофазной ферментации. В промышленной биотехнологии применяются оба метода культивирования штаммов-продуцентов Bacillus. Данные протеазы используются в пищевой промышленности, в кормовой промышленности, в фармацевтической отрасли, при синтезе стереоизомерных соединений, в косметологической индустрии, в кожевенном производстве, при очистке сточных вод. Бациллярные протеазы толерантны к высоким температурам, органическим растворителям и детергентам, что является одной из причин их применения в производстве детергентов. Ряд протеаз из Bacillus уже нашли свое применение в качестве коммерческих ферментов. Однако, высокий промышленный потенциал и широкое разнообразие бациллярных протеаз по-прежнему вызывает интерес у исследователей. Представляется перспективным выделение протеолитических штаммов Bacillus из казахстанских биоценозов и изучение протеолитических ферментов для оценки их практического применения в гидролизе белкового сырья. Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение биохимических характеристик секретируемых протеолитических ферментов штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. В соответствии с поставленной целью, были определены следующие задачи: 1. Провести сбор образцов, провести скрининг, выделить и идентифицировать протеолитические микроорганизмы рода Bacillus. 2. Изучить секреторную протеому протеолитических штаммов Bacillus методами зимографического анализа, белковой масс-спектрометрии, количественной энзимологии. 3. Определить биохимические свойства протеолитических ферментов штаммов Bacillus subtilis А5.3 и Bacillus licheniformis Т7. 4. Определить гидролизующие свойства протеолитических ферментов штаммов Bacillus subtilis А5.3 и Bacillus licheniformis Т7 на различных типах белковых субстратов. 5. Провести сравнительный анализ по протеолитическим ферментам штаммов Bacillus subtilis А5.3 и Bacillus licheniformis Т7. 6. Провести гидролиз кератинсодержащих отходов: куриных перьев, рога, копыта, шкура и шерсти крупного рогатого скота. Определить степень гидролиза, протеолитическую и кератинолитическую активность штамма, оценить возможность использования бациллярных протеолитических ферментов в качестве молокосвертывающего препарата. 7. Провести культивирование штамма-продуцента в условиях глубинной ферментации в биореакторе и получить ферментный препарат протеолитического действия в жидкой и сухой форме. Объекты исследования: штаммы Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Предмет исследования: протеолитические ферменты штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Методы исследования: методы микробиологии, молекулярной биологии, биохимии, масс-спектрометрии, протеомики, секвенирования, геномики, биотехнологии, иммунологии и электронной сканирующей микроскопии. Новизна темы. Научная новизна заключается в том, что впервые из почвы Казахстана выделены протеолитические и кератинолитические штаммы видов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Изучены и идентифицированы их секреторные ферменты. Предложен способ культивирования казахстанских штаммов на перьевой среде и изучена зависимость активности полученных протеолитических и кератинолитических ферментов от различных факторов: температуры, pH, присутствия металлов, детергентов, ингибиторов. Впервые секвенирован и депонирован в базе данных NCBI GenBank под номером CP124861 полный геном казахстанского протеолитического штамма Bacillus licheniformis Т7. Практическая значимость работы. Результаты работы позволят изучить протеолитические ферменты, определить условия их получения и применения для ферментативного гидролиза различных типов белков. Это, в свою очередь, позволит разработать новые биопрепараты протеолитического действия, ориентированные на применение в пищевой, кормовой и перерабатывающей промышленности. Основные положения, выносимые на защиту: - мезофильные микроорганизмы Bacillus subtilis А5.3 и Bacillus licheniformis Т7 продуцируют термостабильные щелочные протеолитические ферменты, относящиеся к сериновым протеазам и металлопротеазам; - протеолитические ферменты, секретируемые бактериями Bacillus subtilis А5.3 и Bacillus licheniformis Т7, обладают широкой субстратной специфичностью и способны к гидролизу фосфопротеидов (казеины), альбуминов (БСА, овальбумин), фибриллярных белков (коллаген и кератин); - для эффективного гидролиза твердых водонерастворимых субстратов большое значение имеет адгезия клеток протеолитических бактерий на поверхности субстрата; - бактериальные штаммы Bacillus subtilis А5.3 и Bacillus licheniformis Т7 секретируют ряд протеолитических ферментов, характеризующихся различной структурой, биохимическими параметрами и совместно гидролизующих белковые субстраты; - штаммы Bacillus subtilis А5.3 и Bacillus licheniformis Т7, выделенные на территории Казахстана являются эффективными продуцентами термостабильных щелочных протеолитических ферментов. Основные результаты исследования. 1. Из образцов почв были выделены бактериальные изоляты, из которых 2 штамма были отобраны на основании результатов скрининга по протеолитической активности. Штаммы были идентифицированы как Bacillus subtilis A5.3 и Bacillus licheniformis T7. При культивировании на перьевой среде штаммы продуцируют протеолитические ферменты, с максимумом продукции на 48-72 часа ферментации. 2. Исследованы биохимические характеристики протеолитических ферментов выделенных штаммов, Bacillus subtilis A5.3 и Bacillus licheniformis T7. Согласно полученным результатам, протеазы относятся к классам сериновых и металлопротеаз, являются щелочными и термостабильными. Протеолитические ферменты, продуцируемые штаммом B. subtilis A5.3 обладают активностью 158,8±2,5 ЕД/мл и 109,3±4,0 ЕД/мл для казеинолитической и кератинолитической активности, соответственно. Для ферментов штамма B. licheniformis T7 казеинолитическая и кератинолитическая активность составила 322,6±4,8 ЕД/мл и 122,0±6,0 ЕД/мл, соответственно. Дополнительно, ферменты штамма B. licheniformis T7 обладают молокосвертывающей активностью на уровне 10 ЕД/мл. Сравнение уровней по кератинолитической и казеинолитической активностями можно отметить, что штамм B. subtilis A5.3 является более кератинолитическим, чем B. licheniformis T7, что можно объяснить источником происхождения штамма – перьевые отходы птицефабрики. 3. Протеолитические ферменты штамма B. subtilis A5.3 ингибируются ионами металлов с одним, двойным или тройным зарядом. Сильное ингибирование, в три раза, наблюдалось от ионов Mn2+; в два раза при добавлении ионов K+, Li+, Mg2+ и Cd2+. Исследование воздействия ионов металлов на активность протеолитических и кератинолитических ферментов экстракта B. licheniformis T7 показало, что однозарядные ионы не оказывают влияния. Сильное ингибирующее воздействие оказывают Ni2+, Co2+, Mn2+ и Cd2+ (10 мМ) на протеолитическую активность. Ионы Cu2+ и Cd2+ (10 мМ) угнетают кератинолитическую активность. Ионы железа (III) (5-10 мМ FeCl3) полностью инактивируют протеолитическую и кератинолитическую активности. Активность протеолитических ферментов штаммов B. subtilis A5.3 ингибировалась редуцирующими агентами и Твин 20 в два раза, в то время как Triton X-100 и ДСН не оказывал значительного влияния на активность. Для ферментов B. Licheniformis присутствие в реакции ДСН снизило показатели обеих видов активности для более чем на 75%. 4. Изучение видового состава протеаз в энзиматических экстрактах штаммов B. subtilis A5.3 и B. licheniformis T7 с использованием методов белковой масс-спектрометрии, протеомики и геномики позволили идентифицировать 13 протеаз и пептидаз в секреторной протеоме штамма B. subtilis A5.3 с молекулярной массой 30,2-85,6 кДа. В секреторной протеоме штамма B. licheniformis T7 идентифицировано 7 протеолитических ферментов: 4 из которых относятся к сериновых пептидазам, а 3 – к металлопептидазам. 5. Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности белка S8-378 показал, что белок содержит сигнальный пептид на 29 а.о., обеспечивающий его секрецию клетками B. licheniformis T7. При секреторной экспрессии в B. licheniformis T7 вследствие автокаталитического действия происходит удаление пропептида и образуется ферментативноактивный вариант белка S8-378. 6. Протеолитические ферменты штаммов B. subtilis A5.3 и B. licheniformis T7 обладают широкой субстратной специфичностью и способны гидролизовать как альбумины (бычий сывороточный альбумин, овальбумин), так и фибриллярные белки (коллагены, кератины). Установлено, что казеин является наиболее чувствительным к действию протеолитических ферментов: 1 мг казеина полностью гидролизуется за 1 минуту. Наиболее устойчивыми для гидролиза выступает кератин. Кератинолитическая активность бактерий B. subtilis A5.3 и B. licheniformis T7 позволяет за 9 и 4 суток, соответственно полностью гидролизовать куриные перья. Значительную роль в эффективности и скорости перьевых субстратов играет адгезия бактериальных клеток с поверхностью пера. Протеолитические ферменты, секретируемые штаммом B. licheniformis T7 в отличие от ферментов штамма B. subtilis A5.3 обладают молокосвертывающей активностью 10 Ед/мл на коровьем молоке и 23 Ед/мл на овечьем молоке. С использованием данных ферментов проведена коагуляция коровьего молока, получены творог и сыр. 7. Полный геном штамма Bacillus licheniformis Т7 секвенирован методом нанопорового секвенирования (технология Oxford Nanopore). В результате были получены и аннотированы полные нуклеотидные последовательности штаммов. Геном штамма Bacillus licheniformis Т7 депонирован в международной базе данных NCBI GenBank за номером CP124861. Полученная информация о геноме штамма позволит проводить его дальнейшее изучение. Апробация работы. Основные положения, результаты, выводы и заключение диссертации изложены в 9 печатных работах, в том числе: 3 статьи в зарубежных научных журналах «PLoS ONE», «Scientific Reports» и «Biology (MDPI)», входящих в 1 и 2 квартили по импакт-фактору в базе Web of Science с процентилями 89, 92 и 69 согласно данным базы Scopus; 3 статьи в республиканских научных журналах, рекомендованных Комитетом по обеспечению качества в сфере науки и высшего образования Министерства науки и высшего образования Республики Казахстан, 2 доклада в материалах международных конференций. На результаты практической работы диссертанта получен Патент Республики Казахстан. Личный вклад диссертанта в обобщение результатов научной работы, рекомендуемой к защите. Обзор литературных источников исследовательской работы, определение поставленной цели и задач, дизайн и проведение экспериментов, анализ и обработка результатов практической работы проводилось при непосредственном участии автора. Связь работы с программой научных исследований. Данная работа была направлена на получение и изучение новых ферментов класса протеаз. Работа проводилась в лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью «Национальный центр биотехнологии». Диссертационная работа выполнялась в рамках проектов AP14869708 «Выделение и изучение новых протеолитических ферментов бактериального происхождения», АР05135454 «Разработка технологии получения штамма-продуцента рекомбинантной кератиназы для переработки малоценного перо-пухового сырья в белковый гидролизат» и Научно-технической программы BR10764944 «Разработка методов аналитического контроля и проведения мониторинга безопасности пищевой продукции». Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах, содержит 13 таблиц, 37 рисунков, 3 приложения. Список цитируемых источников включает 331 ссылку. Структурно диссертация состоит из перечня принятых в диссертации определений, обозначений и сокращений, введения, обзора литературных данных, материалов и методов проведения экспериментов, результатов собственных исследований, заключения, списка использованных источников и приложений.
Отзыв зарубежного консультанта
Заключение комиссии по этической оценке исследований
Решение диссертационного совета
Защита диссертации: https://youtu.be/wKV7DuCuo7s?si=0qEbOhzlhp5M--Hn
