В Евразийском национальном университете имени Л.Н. Гумилева состоится защита диссертации на соискание степени доктора философии (PhD) Ахметовой Айнур Жармухамбетовны на тему «Молекулярно-генетическая характеристика генотипа Beijing Mycobacterium tuberculosis в Казахстане: распространение и ассоциация с лекарственной устойчивостью» по образовательной программе «8D05107 – Биология».
Диссертация выполнена на кафедре «Кафедра Общей биологии и геномики» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева.
Язык защиты - на русском
Официальные рецензенты:
Гайпов Абдужаппар Эркинович – кандидат медицинских наук, ассоциированный профессор Школы медицины Назарбаев университета (г.Астана, Республика Казахстан).
Абельденов Сайлау Касенович - PhD, заведующий Лабораторией молекулярной биотехнологии Национального центра биотехнологии (г. Астана, Республика Казахстан).
Временные члены Диссертационного совета:
Кистаубаева Аида Сериковна – кандидат биологических наук, профессор, заведующая Кафедрой биотехнологии Казахского национального университета имени аль-Фараби (г. Алматы, Республика Казахстан).
Кесов Думитру Иванович - MD, PhD, ассоциированный профессор Кафедры пульмонологии и аллергологии Государственного университета медицины и фармации имени Николая Тестемицану (г. Кишинев, Республика Молдова).
Шайхин Серик Мурзахметович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов Республиканской коллекции микроорганизмов (г. Астана, Республика Казахстан).
Научные консультанты:
Акильжанова Айнур Рахметуловна – доктор медицинских наук, PhD, профессор, руководитель Лаборатории геномной и персонализированной медицины ЧУ «National Laboratory Astana» (г. Астана, Республика Казахстан).
Филипенко Максим Леонидович – доктор биологических наук, заведующий Лабораторией фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск, Российская Федерация).
Защита состоится: 23 июня 2025 года в 11:00 часов в Диссертационном совете по направлению подготовки кадров «8D051 – Биологические и смежные науки» по образовательной программе «8D05107 – Биология» Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева. Проведение заседания диссертационного совета в смешанном (оффлайн и онлайн) формате.
Ссылка:https://us06web.zoom.us/j/84013448647?pwd=MyvzA4yp0DVgPiB1OmiOKaRCrlgLFl.1
Идентификатор конференции: 840 1344 8647
Код доступа: 633666
Адрес: г. Астана, ул. Кажымукана, 13, корпус №3, ауд. №333.
Аннотация (рус.): Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена комплексному изучению молекулярно-генетических и клинико-эпидемиологических свойств генотипа Beijing M. tuberculosis. Актуальность темы исследования. Туберкулез (ТБ) остается одной из основных проблем общественного здравоохранения в мире и является второй по значимости причиной смертности от одного инфекционного агента после коронавирусной инфекции (COVID-19). Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2023 г. 10,8 миллиона человек заболели туберкулезом, из них 8,2 миллиона больных среди впервые выявленных случаев. В тот же год, 1,25 миллиона людей умерли от туберкулеза, включая 161 000 случаев среди ВИЧ-инфицированных. Основным препятствием в борьбе с туберкулезом является широкое распространение устойчивых к лекарственным препаратам M. tuberculosis штаммов. Наибольшую опасность представляют штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), а также штаммы с более сложными формами МЛУ – с пре-широкой лекарственной устойчивостью (пре-ШЛУ) и ШЛУ. В данное время, рифампицин-устойчивость (РУ) применяется как показатель МЛУ-ТБ, среди пациентов с устойчивостью к рифампицину МЛУ-ТБ выявляется в ~80% случаях. По оценкам ВОЗ, в 2023 г. в мире было выявлено 400 000 случаев МЛУ/РУ-ТБ. В Казахстане, несмотря на то, что за последние 21 лет (2002-2023 гг.) значительно снизились показатели заболеваемости и смертности от туберкулеза от 165,1 до 34,7 случаев на 100 000 населения и от 24,2 до 1,12 случаев на 100 000 населения, соответственно, количество случаев с МЛУ-ТБ растет с каждым годом. За 13 лет (2010-2023 гг.) показатели МЛУ-ТБ в стране увеличились в 2 раза от 14 до 28 случаев на 100 000 населения. По данным ВОЗ, Казахстан входит в список 30 стран с самым высоким бременем МЛУ/РУ-ТБ в мире. Согласно исследованиям, МЛУ-ТБ и его широкое распространение ассоциировано с генотипом Beijing M. tuberculosis. Однако, повышенная способность приобретения устойчивости к лекарственным препаратам свойственна не для всех изолятов Beijing и отличается среди разных субгрупп и кластеров генотипа Beijing. Так как в различных географических регионах циркулируют разные изоляты генотипа Beijing актуальным является изучение структуры генотипа Beijing и его клинически и эпидемиологически значимых кластеров в Казахстане для мониторинга лекарственно-устойчивого, в том числе мультирезистентного туберкулеза среди новых и повторных случаев. Предыдущие исследования показывают, что генотип Beijing является самым распространенным генотипом среди штаммов M. tuberculosis в Казахстане и встречался в 70,4%-79% случаях. Однако, в данных исследованиях генотипы (семейства) M. tuberculosis в основном были охарактеризованы на небольшой выборке образцов. В большинстве исследований, полученные результаты были описаны в общей выборке без разделения на новые и повторные случаи. В исследованиях, где анализ проводился среди образцов, выделенных от впервые выявленных и повторных случаев по отдельности, выборки преимущественно включали в себя только лекарственно-устойчивые изоляты либо состояли преимущественно из образцов от повторных случаев ТБ. А сбор изолятов M. tuberculosis в большей степени только от повторно заболевших пациентов делает выборку ограниченной для оценки распространения лекарственной устойчивости в общей популяции. Поэтому для идентификации генотипа Beijing и его особенностей среди казахстанской популяции M. tuberculosis необходимо изучение данного генотипа как среди больных ТБ с впервые выявленными, так и повторными случаями заболевания с включением всех имеющихся образцов на данный момент (устойчивых и чувствительных). В целом, в предыдущих работах, детально не проводилось исследование генотипа Beijing в Казахстане. Ранее не изучалась взаимосвязь данного генотипа и его основных кластеров с клиническими формами заболевания, а также с возрастом и полом больных ТБ, ограничена информация по геномным исследованиям казахстанских лекарственно-устойчивых образцов генотипа Beijing. Поэтому необходимо проведение комплексной молекулярно-генетической и клинико-эпидемиологической характеристики изолятов генотипа Beijing, циркулирующих на территории Казахстана. Объектом исследования являются образцы ДНК клинических изолятов M. tuberculosis, ДНК референсного штамма M. tuberculosis H37Rv. Предметом исследования являются генетические маркеры, обуславливающие лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам и генетические локусы, используемые для идентификации генотипов M. tuberculosis. Цели и задачи исследования Целью исследования является проведение комплексной молекулярно-генетической характеристики генотипа Beijing M. tuberculosis в Казахстане среди новых и повторных случаев туберкулеза. Для достижения цели, поставлены следующие задачи: 1. Определить частоту распространения генотипа Beijing M. tuberculosis среди впервые выявленных случаев и рецидивов в Казахстане. 2. Исследовать ассоциацию генотипа Beijing и его основных кластеров c различными лекарственно-устойчивыми формами ТБ (моно-, полирезистентный ТБ и МЛУ-ТБ), а также с наиболее распространенными мутациями Ser531Leu rpoB гена и Ser315Thr katG гена, ассоциированных с устойчивостью к самым эффективным ПТП 1 ряда – рифампицину и изониазиду, соответственно. 3. Выявить особенности клинико-эпидемиологических параметров туберкулеза при заболевании генотипом Beijing M. tuberculosis. 4. Изучить полные геномы казахстанских изолятов генотипа Beijing с МЛУ, пре-ШЛУ и ШЛУ и апробация различных геномных баз данных для определения лекарственной чувствительности на основе секвенирования нового поколения. Методы исследования. Комплексная молекулярно-генетическая и клинико-эпидемиологическая оценка генотипа Beijing проводилась методами микробиологии, молекулярной биологии, биоинформатики и статистики. Научная новизна исследования. Впервые в Казахстане проведена комплексная молекулярно-генетическая характеристика генотипа Beijing среди новых и повторных случаев ТБ и был выполнен сравнительный анализ данных образцов, полученных от впервые выявленных случаев, рецидивов и в общей выборке. Выявлена частота распространения генотипа Beijing и его доминирующих кластеров. Детально исследованы клинико-эпидемиологические данные больных, зараженных генотипом Beijing. Впервые в Казахстане изучена взаимосвязь генотипа Beijing и его основных кластеров c клиническими формами ТБ, различной лекарственной устойчивостью (моно- и полирезистентная устойчивость, МЛУ) и с наиболее распространенными мутациями Ser531Leu rpoB гена и Ser315Thr katG гена, ассоциированных c устойчивостью к самым эффективным ПТП 1 ряда – рифампицину и изониазиду, соответственно. Впервые нами были охарактеризованы и опубликованы полные геномы лекарственно-устойчивых казахстанских изолятов Beijing (МЛУ, пре-ШЛУ и ШЛУ). Теоретическая значимость исследования. Полученные результаты в рамках данного исследования позволят расширить знания о молекулярно-генетических и клинико-эпидемиологических особенностях самого распространенного генотипа Beijing M. tuberculosis и его основных кластеров среди новых и повторных случаев ТБ в Казахстане и могут быть применены в медицине и фтизиатрии для улучшения стратегических мер по мониторингу и профилактике лекарственно-устойчивого ТБ, в том числе МЛУ-ТБ. Разработанные в рамках диссертационной работы методические рекомендации «Определение семейств клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis по разработанной схеме генотипирования с использованием MIRU-VNTR анализа» на казахском и русском языках могут быть использованы в учебно-образовательном процессе в медицинских ВУЗах, в научных лабораториях и лабораториях противотуберкулезной службы для генотипирования M. tuberculosis. Загруженные в результате нашего исследования геномы M. tuberculosis в международную базу данных NCBI (под номерами PRJNA503963 и PRJNA481625) делают доступной последовательности белков и генов казахстанских Beijing изолятов с МЛУ, пре-ШЛУ и ШЛУ для биомедицинского сообщества и дают возможность получить новые знания для создания вакцин и новых противотуберкулезных препаратов, а также для изучения эволюции микобактерий. Практическая значимость исследования. В рамках нашего исследования была разработана и апробирована схема MIRU-VNTR генотипирования, состоящая из 7 полиморфных локусов, характерных для казахстанских штаммов микобактерий и внедрена в работу ННЦФ МЗ РК (г. Алматы) для предварительных скрининговых исследований популяций M. tuberculosis и выявления кластеров, распространенных в Казахстане. Стандартные схемы MIRU-VNTR генотипирования, в том числе предлагаемая нами схема также могут быть использованы в программе по контролю ТБ для быстрого определения близко-родственных штаммов и путей возможной передачи, определения и дифференциации случаев реактивации туберкулеза от реинфекции, мониторинга вторичных случаев ТБ и идентификации эпидемиологически и клинически важных генотипов во время вспышек заболевания в определенных очагах инфекции. В результате диссертационной работы были отработаны методы подготовки ДНК-библиотек для полногеномного секвенирования на платформах секвенирования нового поколения, а также апробированы шесть геномных баз данных и рекомендованы наиболее оптимальные базы для определения профиля лекарственной чувствительности и идентификации мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к ПТП 1 и 2 ряда. Данные знания могут быть применены в клинической практике для быстрого определения и анализа лекарственной чувствительности штаммов M. tuberculosis в совокупности с микробиологическими методами, что в свою очередь позволит подобрать наиболее эффективную, персонализированную антибиотикотерапию. Основные выводы по результатам исследования 1. Определена частота распространения генотипа Beijing M. tuberculosis среди новых и повторных случаев ТБ в Казахстане – 60% и 78%, соответственно. Идентифицированы основные кластеры данного генотипа (94-32, 96-32, 94-33, 100-32, 96-145 и 99-32), которые составили 65,2% всех Beijing изолятов. Из них 52,5% были отнесены к Central Asian/Russian 94-32 кластеру. 2. Выявлена статистически значимая взаимосвязь генотипа Beijing с лекарственно-устойчивым туберкулезом, включая МЛУ-ТБ во всех группах исследования, с двухкратным преобладанием в группе повторных случаев ТБ по сравнению с новыми случаями. Самый распространенный кластер 94-32 генотипа Beijing (52,5% среди всех Beijing) был связан с заболеванием ЛУ штаммами M. tuberculosis в общей выборке образцов и среди рецидивов, а среди новых случаев с заболеванием МЛУ-ТБ. А кластер Beijing 94-15 был ассоциирован с заражением лекарственно-чувствительным ТБ в общей коллекции образцов и среди повторных случаев ТБ. Среди non-Beijing изолятов, в общей выборке образцов генотип LAM показал статистически достоверную ассоциацию с лекарственно-устойчивым ТБ, включая МЛУ-ТБ. Преобладание генотипа LAM среди резистентных изолятов наблюдалось среди впервые выявленных случаев. Среди рифампицин-устойчивых, а также МЛУ образцов с подтвержденными мутациями в rpoB гене, статистически значимая ассоциация наблюдалась между самой распространенной мутацией Ser531Leu в 531 кодоне rpoB гена и генотипом Beijing. Впервые в Казахстане нами показано, что мутация His526Leu в 526 кодоне rpoB гена была взаимосвязана с генотипом LAM. 3. Выявлены особенности клинико-эпидемиологических параметров туберкулеза при заражении генотипом Beijing M. tuberculosis. Среди возрастных групп генотип Beijing был статистически ассоциирован с заболеванием молодых людей наиболее трудоспособного возраста от 18 до 44 лет в общей выборке и среди рецидивов (p0,05). В общей выборке в целом, женщины заболевали раньше, чем мужчины (средний возраст 36,3 лет vs. 38,1 лет, p=0,02642). Среди пациентов с повторными случаями туберкулеза, средний возраст больных, зараженных генотипом Beijing был значительно ниже, чем у больных с non-Beijing генотипами (39,7 лет vs. 46,6 лет, p=0,00544). А среди зараженных генотипом Beijing, женщины были статистически достоверно моложе, чем мужчины в общей выборке (35,1 лет vs. 37,6 лет, p=0,0232) и среди рецидивов (35,7 лет vs. 41 лет, p=0,00854). Среди кластеров генотипа Beijing такая особенность наблюдалась среди женщин, зараженных самым распространенным Central Asian/Russian 94-32 кластером в общей выборке (p=0,01928). В общей выборке образцов пациенты с фиброзно-кавернозным туберкулезом были статистически больше инфицированы лекарственно-устойчивыми штаммами M. tuberculosis (p=0,0019). Среди больных, зараженных лекарственно-устойчивыми микобактериями взаимосвязь ФКТ была выявлена с МЛУ (p=0,0054). А заражение лекарственно-чувствительными штаммами M. tuberculosis была определена в большей степени у пациентов с очаговым ТБ среди новых случаев (p<0,05). Туберкулезный плеврит был ассоциирован с non-Beijing генотипами среди новых и повторных случаев ТБ (p=0,0430). 4. В результате полногеномного секвенирования Beijing изолятов с МЛУ, пре-ШЛУ и ШЛУ были определены различные типы мутаций (миссенс мутации, варианты сдвига рамки считывания, нонсенс варианты и т.д.), обуславливающие резистентность к противотуберкулезным препаратам, в том числе новые мутации, которые требуют дальнейшего изучения и валидации. Полученные геномы казахстанских Beijing изолятов были загружены в международную базу данных NCBI под номерами PRJNA503963 и PRJNA481625 и доступны для использования биомедицинским сообществом. Апробированы шесть геномные базы данных (ResFinder, CARD, CASTB, TGS-TB, TB-Profiler и Mykrobe) для быстрой диагностики лекарственной чувствительности и анализа мутаций, ассоциированных с ПТП 1 и 2 ряда. Для первичного скрининга лекарственной чувствительности в геномах микобактерий нами рекомендованы три базы данных - ResFinder, TB-Profiler и Mykrobe, а для обширного и детального анализа спектра мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к ПТП 1 и 2 ряда рекомендованы две базы данных - ResFinder и TB-Profiler. Публикации по теме исследования. По результатам исследований в рамках диссертационной работы опубликовано 35 печатных работ, из них 5 статей в журналах, входящих в базы данных Web of Science и Scopus; 5 статей в журналах, входящих в список рекомендованных КОКСНВО МНВО РК; 10 тезисов в изданиях, входящих в базы данных Web of Science и Scopus; 13 тезисов в материалах международных конференций; 2 методические рекомендации. Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, заключения, списка использованных источников, включающих 240 источника и 4 приложений. Диссертационная работа состоит из 26 таблиц и 10 рисунков.
Отзыв зарубежного консультанта
Заключение комиссии по этической оценке исследований
Решение диссертационного совета
Защита диссертации: https://youtu.be/Gvpf-U-DRS8?si=v_68kFWRBfdKspFj
