Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінде философия докторы (PhD) дәрежесін алу үшін Акишев Жигер Дастанович «6D060700 – Биология» мамандығы бойынша «Camelus bactrianus -тың және Bos taurus -тың химозиндерінің құрылымы мен қызметтері» тақырыбында диссертациясы қорғалады.
Диссертация Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің «Жалпы биология және геномика кафедрасы» кафедрасында орындалды.
Қорғау тілі - орыс тілінде
Ресми рецензенттер:
Рожкова Александра Михайловна – химия ғылымдарының кандидаты, Ресей Ғылым Академиясының «Биотехнологияның іргелі негіздері» Федералды зерттеу орталығының ферменттер биотехнологиясы зертханасының аға ғылыми қызметкері (Мәскеу қ., Ресей Федерациясы).
Жигайлов Андрей Викторович – биология ғылымдарының кандидаты, «М.А. Айтхожин атындағы Молекулярлық биология және биохимия институты» ақуыз және нуклеин қышқылдары зертханасының меңгерушісі. (Алматы қ., Қазақстан Республикасы).
Диссертациялық кеңестің уақытша мүшелері:
Шайхин Серик Мурзахметович – биология ғылымдарының докторы, Микроорганизмдердің республикалық коллекциясының микроорганизмдердің генетика және биохимия зертханасының меңгурушісі (Астана қ., Қазақстан Республикасы).
Гончарова Алла Владимировна – биология ғылымдарының кандидаты, Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық университетінің биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасының доценті (Алматы қ., Қазақстан Республикасы).
Кушугулова Алмагуль Рахимберлиевна – медицина ғылымдарының докторы, адам микробиомасы және ұзақ өмір сүру зертханасының басшысы, өмір туралы ғылымдар орталығы, Астана ұлттық зертханасы, Назарбаев Университеті (Астана қ., Қазақстан Республикасы).
Ғылыми кеңесшілері:
Хасенов Бекболат Бауыржанович – химия ғылымдарының кандидаты, биология ғылымдары мамандығы бойынша профессор, Ұлттық биотехнология орталығының микроорганизмдердің генетикасы және биохимиясы зертханасының меңгерушісі (Астана, Қазақстан).
Сапарбаев Мұрат Қалиевич – биология ғылымдарының кандидаты, Густав Русси институтының ДНҚ жөндеу зертханасының меңгерушісі (Вильежуиф, Франция).
Қорғау 2025 жылғы 25 ақпан, сағат 12:00 Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің «6D060700 – Биология» мамандығы бойынша «8D051 – Биологиялық және сабақтас ғылымдар» кадрларды даярлау бағыты бойынша диссертациялық кеңесте өтеді. Диссертациялық кеңес мәжілісі аралас форматта (оффлайн және Microsoft Teams платформасында онлайн) өткізіледі деп жоспарлануда.
Сілтемесі: https://clck.ru/3FkLBB
Мекен-жайы: 010008, г. Астана, ул. Кажымукана, 13, корпус №3, ауд. №333
Аңдатпа (қаз.): Жұмыстың жалпы сипаттамасы Диссертация Bos taurus және Camelus bactrianus рекомбинантты химозиндерінің биохимиялық қасиеттерін зерттеуге арналған. Тақырыптың өзектілігі Протеолиз – протеолитикалық ферменттер, протеиназалар, протеазалар немесе пептидазалар деп аталатын ферменттермен пептидтік байланысты гидролиздеу арқылы жүретін ақуыздар мен пептидтердің кішірек пептидтерге немесе аминқышқылдарына дейін ыдырауы. Бұл жұмыстың негізгі нысаны болып табылатын аспарагин протеиназалары табиғатта кең таралған; олар сүтқоректілерде, құстарда, балықтарда, өсімдіктерде, саңырауқұлақтарда, бактериялар және вирустарда кездеседі. Табиғатта аспарагиндік протеазалар орындайтын қызметтердін кең спектрі оларды қарқынды зерттеу мен шаруашылық қызметтің әртүрлі салаларында қолданудың себебі болып табылады. Сүт және оның өңделген өнімдері неолиттік революциядан бері адамның негізгі тамақтану көздеріне жатады. 2023 жылы әлемдік сүт өндірісі 965 млн. тоннаны құрады, бұл 2016 жылмен салыстырғанда 18% - ға жоғары және 2000 жылмен салыстырғанда 70% астам. Сүтті алудың негізгі көзі ірі қара мал. Сиыр мен буйвол сүтінің жалпы өндірісінің үлесі 96% деңгейінде азды-көпті тұрақты болып қалады (сиыр мен буйвол сүті әлемдік сүт өндірісінің сәйкесінше 81% және 15,2% құрайды). 2021 жылы ешкі, қой және түйе сүті әлемдік өндірістің сәйкесінше 2,3%, 1,2% және 0,4%-дарына тең. Бұл сүт Жерорта теңізі, Батыс және Оңтүстік-Шығыс Азия аймақтарының ауыл шаруашылығында маңызы зор. Бұғы, есек және бие сүттерінің қолданысы кең емес, бірақ мұндай сүттің жекелеген ұлттар мен этностар үшін мәдени маңызы зор. Ірі қара малдан алынған сүттің басым болуына қарамастан, жақында сүттің басқа түрлері денсаулыққа тигізетін пайдасы мен гипоаллергендігіне байланысты, балаларға арналған сүт тағамдары құрамында қолдану мүмкіндігіне байланысты кең зерттеулердің басты назарын аударуда. Қазіргі уақытта, ірімшік өндіру үрдісінде, сүтті ұюту үшін жануарлардан, өсімдіктерден және микробтардан алынған коагулянттар қолданылады, бірақ дәстүрлі түрде ірімшік өндірісінде күйіс қайыратын жануарлардың төртінші асқазан (абомасум) безді жасушалары шығаратын абомасумның ферменті қолданылады. Ең көп мөлшерде абомасумның ферменті бұзаулар, ешкілер мен қозылар өмірінің алғашқы сүт кезеңінде түзіледі, сондықтан абомасумның ферментін алу үшін тек жас жануарлардың абомасумдары қолданылады (3-10 күннен бастап). Абомвссумның ферменті деп те аталатын ренин-бұл екі эндопептидазаның қоспасы: пепсин және химозин . Рениннің құрамында химозин 10% - дан 90% - аралығындағы мөлшерін қамтиды, препарат құрамында басым бөлігі немесе толықтай химозин болатын, ірімшік жасауда ең үлкен құндылыққа ие, өйткені оның құрамы ірімшіктің органолептикалық және дәмдік қасиеттеріне қатты әсер етеді. Бастапқыда химозин инактивтендірілген түрінде түзіледі, прохимозин, содан кейін рН көрсеткіші төмен автокаталитикалық протеолиз арқылы 36 кДа молекулалық салмағы бар белсенді химозин күйіне келеді. Белсендірілгеннен кейін фермент белгілі бір нүктеде казеин ақуызын ыдыратады және сүттің ұюына ықпал етеді. Фермент капа-казеин молекуласындағы Phe105 пен Met106 арасындағы байланысты гидролиздейді, бұл казеин мицелийінің тұрақсыздығына және ұйытқының пайда болуына әкеледі. Әлемдік ірімшік өндірісінің өсуінің шектеуші факторы сойылатын жануарлар санының азаюымен байланысты, бұл химозиннің альтернативті көздерін іздеуге зерттеулерді ынталандырады. Іс жүзінде зең саңырауқұлақ және өсімдік тектес химозиндер қолданылады, бірақ олардың ірімшік жасаудағы құндылығы төмен. Жануарлардан алынатын құнды химозиннің альтернативті көзі – рекомбинантты ДНҚ технологиясын қолдану болып табылады. Зең саңырауқұлақтардағы химозин өндірісі үшін Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Trichoderma reesei өкілдері қолданылады, бірақ одан да тиімді әдіс-ашытқыларда химозинді алу. Ең тиімдісі – Рichia (Komagataella) Pastoris негізіндегі экспрессиялық жүйе, ол өзінің бөлінетін ақуыздарының деңгейі салыстырмалы түрде төмен болып келеді, бұл рекомбинантты ақуызды тазартуды айтарлықтай жеңілдетеді және соның арқасында нарыққа терапевтік және өнеркәсіптік қолданбалы ақуыз өнімдерінің кең ауқымы шығарылды. Белгілі және қолданыстағы сүт-ұютушы ферменттермен қатар, жаңа ферменттерді іздеу бойыша жұмыстар жүргізілуде, мысал ретінде испан артишокынан (Cynara cardunculus) алынатын пепсиннің өсімдік аналогы, як химозині (Bos mutus), бизон (Bison bison) немесе бір өркешті түйе Camel dromedarius химозиндерін қолдануға болады. Әрине, микробиалды реннин жануарлардан алынатын химозиндерге қарағанда арзанырақ, бірақ Rhizomucor miehei-ден алынған реннинді қолдану арқылы алынған ірімшіктің құрылымы мен органолептикалық қасиеттері түйе химозинін қолдану арқылы алынған ірімшіктерден төмен, оны ашытқыдан ғана емес, сонымен қатар Aspergillus niger саңырауқұлақ жасушаларында да алуға болады. Ұсынылған жұмыс молекулалық биология, энзимология, биохимия, өнеркәсіптік және азық-түлік биотехнологияның түйіскен жерінде орналасқан. Молекулалық-биохимиялық бөлімі, қазіргі таңда геномдары белгілі қос тұяқты тұқымдастардың екі рекомбинантты химозиндерін алуға және зерттеуге арналады: түйе Camelus bactrianus және Bos taurus молекулалық биология мен биохимия әдістерінің заманауи арсеналын қолдана отырып, биоинформатикалық талдау, de novo гендерін құрастыру, сайтқа бағытталған мутагенез, көп деңгейлі скринингтік жүйе, протеомика әдістерін қолдану және биохимиялық талдау әдістері. Диссертацияның биотехнологиялық бөлігі биореактордағы терең дақылдандыру әдісімен мақсатты химозиннің микробтық синтез әдісін қолдануды қамтиды. Ірімшік және сүзбе жасауда рекомбинантты химозинді қолдану, тағам биотехнологиясында рекомбинантты химозиндерді қолдануды білдіреді. Жұмыстың ғылыми өзектілігі және теориялық маңыздылығы Camelus bactrianus-тын прохимозин Б генінің нуклеотидтік тізбегі алғаш рет клондалған. рET28c(+), pGAPZαA және pPICZαA экспрессиялық векторларының негізінде алғаш рет артиодактилді B. Taurus және C. bactrianus прохимозин Б гендерінің нуклеотидтік тізбегін қамтитын плазмидтік құрылымдар жасалды. Алғаш рет рекомбинантты бұзау мен түйе химозиндерінің биохимиялық қасиеттерін, соның ішінде ферменттердің спецификалық және жалпы протеолитикалық белсенділіктері анықталды. Алғаш рет сүттің әртүрлі түрлеріндегі сүтті ұюту белсенділігі зерттелді. Зерттеудің мақсаты мен міндеттері. Зерттеудің мақсаты автокаталитикалық, протеолитикалық және коагуляциялық белсенділікті анықтай отырып, Camelus bactrianus және Bos taurus рекомбинантты химозиндерінің биохимиялық сипаттамаларын зерттеу болып табылады. Осы мақсатқа жету үшін келесі міндеттер алдыға қойылды: 1. In silico-да есептеу және Camelus bactrianus және Bos taurus-тен толық өлшемді препрохимозин Б гендерінің синтезі. Бактериялық вектор құрамындағы бұзау препрохимозин Б генін клондау, Escherichia coli жасушаларындағы жасушаішілік экспрессия және аффиндік хроматография арқылы рекомбинантты ақуызды тазарту. Химозин Б-ға қарсы поликлоналды антиденелер алу. 2. Ашытқы векторларының құрамында бұзау және түйе Прохимозин Б гендерін клондау, Pichia pastoris-те секреторлық әдіспен рекомбинантты ақуыздарды алу және оларды ион алмасу хроматографиясымен тазарту. 3. Сүт ұюының және жалпы протеолитикалық белсенділіктің биохимиялық параметрлерін зерттеу және Camelus bactrianus және Bos taurus рекомбинантты химозиндерінің субстраттық ерекшелігін анықтау. 4. Биореактордағы терең дақылдандыру арқылы Bos taurus және Camelus bactrianus-тан рекомбинантты химозиндерді алу және сүттің әртүрлі түрлерін коагуляциялау бойынша сынақ тәжірбиелерін жүргізу. 5. Аспарагинді пепсин тәрізді протеазалардың биохимиялық және кинетикалық параметрлерін анықтаудың сандық әдісін әзірлеу. Зерттеу нысандары: Bos taurus және Camelus bactrianus-тардың химозин Б аспарагинді протеиназалары. Зерттеу пәні: бұзау мен түйе химозиндерінің биохимиялық қасиеттері. Зерттеу әдістері: микробиология, молекулалық биология, биохимия, генетикалық инженерия, биотехнология әдістері. Жұмыстың практикалық маңыздылығы. Сүт ұюту ферменттерінің секрециясына қабілетті рекомбинантты өндіруші штамдары әзірленді. Ірімшік жасау үшін оңтайлы технологиялық қасиеттер кешеніне ие бұзау мен бактриан түйесі химозиндерінің рекомбинантты аналогтар алынды. Ферменттер сүт өңдеу кәсіпорындарын қызықтырады. Нақты және сұранысқа ие өнімдерді ала отырып, сүтті кешенді өңдеуде қолдану мүмкіндігімен ірімшік өндірісінде сұранысқа ие биопрепаратты алу технологиясы әзірленді. Қорғауға шығарылатын негізгі кағидаттар Қорғауға ғылыми қызметтің мынадай нәтижелері шығарылады: 1. Құрамында 1% Ашытқы сығындысы, 2% пептон, 100 мМ цитрат-фосфат буфері (рН 4,0), 10 мМ аскорбин қышқылы, 5% сорбитол, 1% қызылша мелассасы және 4% глюкоза бар ортада рекомбинантты химозин өндіретін Pichia pastoris штаммдарын өсіру, сүт-ұю белсенділігі бар фермент дақылының әр литрінен 20 мг дейін алуға мүмкіндік береді,. 2. Эукариоттық экспрессия жүйесінде алынған B. taurus бұзаудың мен C. bactrianus туйенің рекомбинантты химозиндері рН 4,5 және 0-55℃ температурада максималды белсенділігі бар қышқыл аспарагинді протеазалар болып табылады. Химозиндер металға тәуелді ферменттер болып табылады, олардың белсенділігі кальций иондарының қатысуымен жоғарылайды, түйе мен бұзау химозиндері үшін максималды белсенділігі 30-40 мМ CaCl2 және никель иондарымен сәйкесінше 80-100% дейін тежеледі. 3. Екі өркешті түйенің рекомбинантты химозині бұзау химозинінің сүт ұюту белсенділігіне қарағанда сиыр, ешкі, қой және түйе сүттері үшін сәйкесінше 29%, 46%, 40% және 31% жоғары белсенділігіне ие. Бие сүтінде түйе химозинінің ерекше белсенділігі бұзау химозинінің белсенділігінен 15 есе көп. 4. Рекомбинантты түйе химозині-бұзау химозиніне қарағанда жоғары спецификалық сүт-коагуляциялық протеаза, өйткені түйе химозиніндегі спецификалық сүт-коагуляция белсенділігінің жалпы протеолитикалық белсенділікке қатынасы бұзау химозинінің ұқсас көрсеткішінен 8,3 есе жоғары. 5. Биотинилденген белгісі бар κ-казеиннің клондалған фрагментін қолдануға негізделген әдіс пепсин тәрізді протеиназалардың белсенділігін сапалы және сандық түрде анықтауға мүмкіндік береді. Жұмысты апробациялау. Диссертацияның негізгі қағидаттары, нәтижелері мен қорытындылары 12 баспа жұмыстарында баяндалған, оның ішінде: Thomson Reuters, Scopus дерекқорларына кіретін және web of Science базасында импакт-фактор бойынша 1-квартильге кіретін "Biology (MDPI)" шетелдік ғылыми журналында 1-мақала; Web of Science базасында 1-мақала Thomson Reuters, Scopus дерекқорларына кіретін және web of Science базасындағы импакт-фактор бойынша 2-ші квартильге кіретін "Heliyon" шетелдік ғылыми журналы; Қазақстан Республикасы Ғылым және жоғары білім министрлігінің Ғылым және жоғары білім саласындағы сапаны қамтамасыз ету Комитеті ұсынған республикалық ғылыми журналдарда 6 мақала; 1 "European Biotechnology Congress -2017" халықаралық конференциясының (Дубровник, Хорватия, 2017) материалдарында Web of Science базасындағы импакт-фактор бойынша 2-ші квартильге кіретін "Journal of Biotechnology" журналында жарияланған баяндама; 1 "микробтық Биотехнология: іргелі және қолданбалы аспектілер" халықаралық конференциясының материалдарындағы баяндама (Минск, Беларусь, 2017); 1 Web of Science базасында импакт-фактор бойынша 2-квартильге кіретін "Journal of Biotechnology" журналында жарияланған "European Biotechnology Congress-2018" халықаралық конференциясының (Афина, Греция, 2018) материалдарындағы баяндама; 1 "Астана Биотех-2018" (Астана, Қазақстан, 2018). Диссертацияның практикалық жұмысының нәтижелеріне Қазақстан Республикасының 2 патенті алынды. Жұмыстың ғылыми зерттеулер бағдарламасымен байланысы. Бұл жұмыс Bos taurus және Camelus bactrianus рекомбинантты химозиндердің биохимиялық қасиеттерін алуға және зерттеуге бағытталған. Жұмыс "Ұлттық биотехнология орталығы" жауапкершілігі шектеулі серіктестігінің микроорганизмдердің генетикасы мен биохимиясы зертханасында орындалды. Диссертациялық жұмыс 5134/ГФ «Сүтті терең өңдеуге арналған химозин мен β-галактозидазаның гендік-инженерлік ферменттік препараттарын алу», АР05133470 «Сүт өнеркәсібі кәсіпорындарында сұранысқа ие рекомбинантты түйе сут-ұютатын ферментін алу технологиясын әзірлеу және штамм-продуцент құру» және BR10764998 ғылыми-техникалық бағдарламасы «Арнайы диеталық тамақ өнімдерін өндіруде пайдалы микроорганизмдердің, ферменттердің, нутриенттердің және басқа да жиынтықтардың жаңа штамдарын пайдалана отырып технологияларды әзірлеу» шеңберінде орындалды. Диссертацияның көлемі мен құрылымы. Диссертация 150 бетте көрсетілген, 16 кесте, 63 сурет, 3 қосымша бар. Келтірілген дереккөздердің тізіміне 360 сілтеме кіреді. Құрылымдық жағынан диссертацияда қабылданған анықтамалардан, белгілер мен қысқартулар тізімінен, кіріспеден, әдеби деректерге шолудан, тәжірбиелер жүргізу материалдары мен әдістерінен, өз зерттеулерінің нәтижелерінен, қорытындыдан, пайдаланылған дереккөздер тізімінен және қосымшаны қамтитын үш тараудан тұрады.
Зерттеулерді этикалық бағалау жөніндегі комиссияның қорытындысы
Диссертациялық кеңестің шешімі
Диссертация қорғауының бейнежазбасы: https://youtu.be/GjcuPa5QTTM?si=DGNojhiyWl9UzwLJ
