Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінде философия докторы (PhD) дәрежесін алу үшін Актаева Сания Айдарбековна «6D060700 – Биология» мамандығы бойынша «Bacillus licheniformis және Bacillus subtilis протеолитикалық ферменттерінің биохимиялық сипаттамаларын оқшаулау және зерттеу» тақырыбында диссертациясы қорғалады.
Диссертация Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің «Жалпы биология және геномика кафедрасы» кафедрасында орындалды.
Қорғау тілі - орыс тілінде
Ресми рецензенттер:
Зоров Иван Никитич – химия ғылымдарының кандидаты, Ресей Ғылым Академиясының «Биотехнологияның іргелі негіздері» Федералды зерттеу орталығының ферменттер биотехнологиясы зертханасының аға ғылыми қызметкері (Мәскеу қ., Ресей Федерациясы);
Ли Константин Григорьевич – биология ғылымдарының кандидаты, академик Е.А. Бөкетов атындағы Қарағанды мемлекеттік университетінің Биотехнология және экомониторинг зерттеу паркінің аға ғылыми қызметкері. (Қарағанды қ., Қазақстан Республикасы).
Диссертациялық кеңестің уақытша мүшелері:
Бисенбаев Амангелді Қуанбайұлы – биология ғылымдарының докторы, профессор, әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университетінің Биология және биотехнология мәселелері ғылыми-зерттеу институтының директоры (Алматы қ., Қазақстан Республикасы);
Қожахметов Самат Серикович – биология ғылымдарының кандидаты, доцент, ММ «National laboratory Astana», микробиом зертханасының жетекші ғылыми қызметкері, Өмір туралы ғылымдар орталығы, Назарбаев Университеті (Астана қ., Қазақстан Республикасы);
Чулкин Андрей Михайлович – биология ғылымдарының кандидаты, «Биотехнологияның іргелі негіздері» Федералды зерттеу орталығының ферменттер биотехнологиясы зертханасының ғылыми қызметкері (Мәскеу қ., Ресей Федерациясы).
Ғылыми кеңесшілері:
Хасенов Бекболат Бауыржанович – химия ғылымдарының кандидаты, биология ғылымдары мамандығы бойынша профессор, Ұлттық биотехнология орталығының микроорганизмдердің генетикасы және биохимиясы зертханасының меңгерушісі (Астана қ., Қазақстан Республикасы);
Сапарбаев Мұрат Қалиевич – биология ғылымдарының кандидаты, Густав Русси институтының ДНҚ жөндеу зертханасының меңгерушісі (Вильежуиф қ., Франция).
Қорғау 2025 жылғы 12 наурыз, сағат 12:00-де Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің «6D060700 – Биология» мамандығы бойынша «8D051 – Биологиялық және сабақтас ғылымдар» кадрларды даярлау бағыты бойынша диссертациялық кеңесте өтеді. Диссертациялық кеңес мәжілісі аралас форматта (оффлайн және онлайн) өткізіледі деп жоспарлануда.
Сілтемесі: https://clck.ru/3G6KFu
Мекен-жайы: Астана қ., Қажымұқан көшесі, 13, Ғимарат №3, Мәжіліс залы (№333 ауд.).
Аңдатпа (қаз.): Жұмыстың жалпы сипаттамасы. Диссертация Bacillus licheniformis және Bacillus subtilis бактериялары бөліп шығаратын протеолитикалық ферменттерді зерттеуге арналған. Тақырыптың өзектілігі. Протеолитикалық ферменттер немесе протеазалар – ақуыздарды пептидтік байланыстар бойынша гидролиздейтін ферменттер, олар сериндік, цистеиндік, аспартатты және металлопротеазалар отбасыларына жіктеледі. Протеазалар барлық тірі ағзаларда кездеседі: микробтарда, жануарларда және өсімдіктерде, бірақ өндірістік биотехнологияда ферменттердің көпшілігі микробтық синтез арқылы алынады. Протеазалардың микробтық көздерінің ішінде бейтарап және сілтілі рН мәндерінде белсенді протеазаларды шығару қабілеті жоғары Bacillus бактериялары перспективалы болып көрінеді. Бацилярлық протеаза түзетін штаммдар арзан қоректік орталарда өсе алады, бұл маңызды, өйткені орта компоненттерінің құны ферменттің өзіндік құнының 40% дейін құрауы мүмкін. Микробтық протеазаларды өнеркәсіптік өндіру үшін биореакторларда терең және қатты фазалық дақылдандыру әдістерін қолданылады. Bacillus өндіруші-штаммдарды өсірудің екі әдісі де өнеркәсіптік биотехнологияда қолданылады. Бациллярлы протеазалар азық-түлік өнеркәсібінде, жем өнеркәсібінде, фармацевтика саласында, стереоизомерлік қосылыстардың синтезінде, косметология индустриясында, былғары өндірісінде, ағынды суларды тазартуда, қолданылады. Bacillus протеазаларының бірқатары коммерциялық ферменттер ретінде өз жолын тапты. Дегенмен, жоғары өнеркәсіптік әлеует және бацилярлық протеазалардың алуан түрлілігі әлі де зерттеушілерді қызықтырады. Бацилланың протеолитикалық штаммдарын қазақстандық биоценоздардан бөліп алу және протеолитикалық ферменттерді олардың ақуыз шикізатының гидролизінде практикалық қолданылуын бағалау үшін зерттеу перспективалы болып көрінеді. Зерттеудің мақсаты мен міндеттері. Зерттеудің мақсаты-Bacillus subtilis және Bacillus licheniformis штаммдарының протеолитикалық ферменттерін зерттеу. Қойылған мақсатқа сәйкес келесі міндеттер анықталды: 1. Үлгілерді жинау, скрининг жүргізу, Bacillus тұқымдасының протеолитикалық микроағзаларын бөліп алу және анықтау. 2. Зимографиялық талдау, ақуыз масс-спектрометриясы, сандық энзимология әдістерімен Bacillus протеолитикалық штаммдарының секреторлық протеомасын зерттеу. 3. Bacillus subtilis А5.3 және Bacillus licheniformis Т7 штаммдарының протеолитикалық ферменттерінің биохимиялық қасиеттерін анықтау. 4. Ақуыз субстраттарының әртүрлі түрлерінде Bacillus subtilis А5.3 және Bacillus licheniformis Т7 штаммдарының протеолитикалық ферменттерінің гидролиздік қасиеттерін анықтау. 5. Bacillus subtilis А5.3 және Bacillus licheniformis Т7 штаммдарының протеолитикалық ферменттері бойынша салыстырмалы талдау жүргізу. 6. Құрамында кератин бар қалдықтардың, соның ішінде тауық қауырсындарының, мүйіздердің, тұяқтардың, ірі қара малдың терісі мен жүнінің гидролизін жүргізу. Штаммның гидролиз дәрежесін, протеолитикалық және кератинолитикалық белсенділігін анықтау, сондай-ақ бациллярлы протеолитикалық ферменттерді сүт ұюына арналған агент ретінде қолдану мүмкіндігін бағалау. 7. Биореактордағы терең ашыту жағдайында продуцент-штаммды өсіру және протеолитикалық әсері бар ферменттік препаратты сұйық және құрғақ түрінде алу. Зерттеу нысандары: Bacillus subtilis және Bacillus licheniformis штаммдары. Зерттеу тақырыбы: Bacillus subtilis және Bacillus licheniformis штаммдарының протеолитикалық ферменттері. Зерттеу әдістері: микробиология, молекулалық биология, биохимия, масс-спектрометрия, протеомика, секвенирлеу, геномика, биотехнология, иммунология және электронды сканерлеу микроскопиясы әдістері. Тақырыптың өзектілігі. Ғылыми өзектілігі-Қазақстанның топырағынан алғаш рет Bacillus subtilis және Bacillus licheniformis түрлерінің протеолитикалық және кератинолитикалық штамдары бөлініп алынған. Олардың секреторлық ферменттері анықталды және зерттелді. Қауырсынды ортада қазақстандық штаммдарды өсіру тәсілі ұсынылды және алынған протеолитикалық және кератинолитикалық ферменттер белсенділігінің әртүрлі факторларға: температураға, pН, металдардың, жуғыш заттардың, ингибиторлардың болуына тәуелділігі зерттелді. Алғаш рет NCBi GenBank деректер базасында CP124861 нөмірімен Bacillus licheniformis T7 қазақстандық протеолитикалық штаммының толық геномы секвенирленген және сақталған. Жұмыстың практикалық маңыздылығы. Жұмыстың нәтижелері протеолитикалық ферменттерді зерттеуге, оларды алу шарттарын анықтауға және әр түрлі ақуыздардың ферментативті гидролизіне қолдануға мүмкіндік береді. Бұл өз кезегінде тамақ, жем және қайта өңдеу өнеркәсібінде қолдануға бағытталған протеолитикалық әсері бар жаңа биопрепараттарды жасауға мүмкіндік береді. Қорғауға шығарылатын негізгі ережелер: - Bacillus subtilis A5.3 және Bacillus licheniformis T7 мезофильді микроағзалары серин және металлопротеазаларға қатысты термотұрақты сілтілі протеолитикалық ферменттер шығарады; - Bacillus subtilis A5.3 және Bacillus licheniformis T7 бактериялары бөлетін протеолитикалық ферменттер кең субстраттық ерекшелікке ие және фосфопротеидтердің (казеиндер), альбуминдердің (BSA, овальбумин), фибриллярлық ақуыздардың (коллаген, кератин) гидролизіне қабілетті; - қатты, суда ерімейтін субстраттарды тиімді гидролиздеу үшін субстрат бетіндегі протеолитикалық бактериялардың жасушаларының адгезиясы үлкен маңызға ие; - Bacillus subtilis A5.3 және Bacillus licheniformis T7 бактериялық штамдары әртүрлі құрылымдармен, биохимиялық параметрлермен және ақуыз субстраттарын бірлесіп гидролиздейтін бірқатар протеолитикалық ферменттерді бөледі; - Қазақстан аумағында оқшауланған Bacillus subtilis A5.3 және Bacillus licheniformis T7 штамдары термотұрақты сілтілі протеолитикалық ферменттердің тиімді өндірушілері болып табылады. Зерттеудің негізгі нәтижелері. 1. Топырақ үлгілерінен бактериялық изоляттар бөлініп алынды, олардың 2 штаммы протеолитикалық белсенділік скринингінің нәтижелері негізінде таңдалды. Штамдар Bacillus subtilis A5.3 және Bacillus licheniformis T7 ретінде анықталды. Қауырсынды ортада өсіргенде штаммдар протеолитикалық ферменттер бөледі, ең көбі 48-72 сағат ашыту үшін өндіріледі. 2. Бөлініп алынған штаммдардың, Bacillus subtilis A5.3 және Bacillus licheniformis T7 протеолитикалық ферменттерінің биохимиялық сипаттамалары зерттелді. Алынған нәтижелер бойынша протеазалар сериндік және металлопротеазалар класына жатады, сілтілі және термотұрақты. B. subtilis A5.3 штаммының протеолитикалық ферменттері казеинолитикалық және кератинолитикалық белсенділік үшін сәйкесінше 158,8±2,5 бірлік/мл және 109,3±4,0 бірлік/мл көрсетті. B. licheniformis T7 штамының ферменттері үшін казеинолитикалық және кератинолитикалық белсенділік сәйкесінше 322,6±4,8 бірлік/мл және 122,0±6,0 бірлік/мл болды. Сонымен қатар, B. licheniformis T7 штаммының ферменттері 10 бірлік/мл деңгейінде сүт ұю белсенділігіне ие. Кератинолитикалық және казеинолитикалық белсенділік деңгейлерін салыстыра отырып, B. subtilis A5.3 штаммының B. licheniformis T7-ге қарағанда кератинолиттік қасиеті жоғары екенін атап өтуге болады, бұл штаммның шығу тегімен (құс фабрикасының қауырсынының қалдықтары) түсіндіріледі. 3. B. subtilis A5.3 штаммының протеолитикалық ферменттері бір, екі немесе үш зарядты металл иондарымен тежеледі. Күшті тежелу Mn2+ иондарынан үш есе байқалды; K+, Li+, Mg2+ және Cd2+ иондарын қосқанда екі есе. CS+, Ni2+, Zn2+, Fe3+ және Al3+ иондарын қосқанда белсенділіктің 35-40% төмендеуі анықталды. Na+ және Cu2+ иондарын қолданған кезде белсенділіктің өте аз төмендеуі байқалады. B. licheniformis T7 сығындысының протеолитикалық және кератинолитикалық ферменттерінің белсенділігіне металл иондарының әсерін зерттеу бір зарядты иондардың әсер етпейтінін көрсетті. Ni2+, Co2+, Mn2+ және Cd2+ (10 мМ) протеолитикалық белсенділікке күшті ингибиторлық әсер етеді. Cu2+ және Cd2+ (10 мМ) иондары кератинолитикалық белсенділікті тежейді. Темір (III) иондары (5-10 мМ FeCl3) протеолитикалық және кератинолитикалық белсенділіктерді толығымен инактивациялайды. B. subtilis 5.3 штаммдарының протеолитикалық ферменттерінің белсенділігі төмендететін агенттермен және Tween 20-мен екі есе тежелді, ал Triton X-100 және SDS белсенділікке айтарлықтай әсер етпеді. B. licheniformis T7 ферменттері үшін SDS реакциясында болу белсенділіктің екі түрінің де көрсеткіштерін 75% - дан астамға төмендетті. 4. B. subtilis A5.3 және B. licheniformis T7 штаммдарының энзиматикалық сығындыларындағы протеазалардың түрлік құрамын зерттеу ақуыз масс-спектрометриясын, протеомиканы және геномиканы пайдалана отырып жүргізілді. Бұл 30,2-85,6 кДа молекулалық салмағы бар B. subtilis A5.3 штаммының секреторлық протеомасындағы 13 протеаза мен пептидазаны анықтауға мүмкіндік берді. B. licheniformis T7 7 протеолитикалық ферменттер анықталды, олардың 4-і сериндік пептидазаларға, ал 3-і металлопептидазаларға жатады 5. S8-378 ақуызының аминқышқылдарының тізбегін биоинформатикалық талдау ақуыздың белгілі кератиназа KerA-ға 60% - дан астам гомологты екенін және оның B. licheniformis T7 жасушаларымен секрециясын қамтамасыз ететін 29 а.о. сигналдық пептидті қамтитынын көрсетті. Секреторлық экспрессия кезінде B. licheniformis T7 автокаталитикалық әсерге байланысты пропептид (76 а.о.) жойылады және S8-378 ақуызының ферменттік белсенді нұсқасы түзіледі. 6. B. subtilis A5.3 және B. licheniformis T7 штаммдарының протеолитикалық ферменттері кең субстраттық ерекшелікке ие және альбуминдерді (сиыр сарысуындағы альбумин, сопақша) және фибриллярлық ақуыздарды (коллагендер, миозин, кератиндер) гидролиздеуге қабілетті. Казеин протеолитикалық ферменттердің әсеріне ең сезімтал екені анықталды: 1 минут ішінде 1 мг казеин толығымен гидролизденеді. Гидролизге ең төзімді кератин. B. subtilis А5.3 және B. licheniformis T7 сәйкесінше 9 және 4 күнде тауық қауырсындарын толығымен гидролиздеуге қабілетті. Қауырсын субстраттарының тиімділігі мен жылдамдығында бактерия жасушаларының қауырсын бетімен адгезиясы маңызды рөл атқарады. B. licheniformis T7 штаммынан бөлінетін протеолитикалық ферменттер сиыр сүтінде 10 бірлік/мл және қой сүтінде 23 бірлік/мл сүт ұю белсенділігіне ие. Осы ферменттерді пайдалана отырып, сиыр сүті коагуляцияланды, сүзбе мен ірімшік алынды. 7. Bacillus licheniformis T7 штаммының толық геномы нанопорлық секвенирлеу әдісімен секвенерленген (Oxford Nanopore технологиясы). Нәтижесінде штаммның толық нуклеотидтер тізбегі алынды және түсіндірілді. Bacillus licheniformis T7 штаммының геномы NCBI GenBank халықаралық деректер базасында CP124861 нөмірімен сақталған. Штамм геномы туралы алынған ақпарат оны әрі қарай зерттеуге мүмкіндік береді. Жұмысты апробациялау. Диссертацияның негізгі ережелері, нәтижелері мен қорытындылары 9 баспа жұмыстарында баяндалған, оның ішінде: Web of Science базасында импакт-фактор бойынша 1 және 2 квартильлерге кіретін "PLoS ONE", "Scientific Reports" және "Biology (MDPI)" шетелдік ғылыми журналында 3 мақалалар; Ғылыми еңбектің негізгі нәтижелерін жариялау үшін Қазақстан Республикасы Ғылым және жоғары білім министрлігінің Ғылым және жоғары білім саласында сапаны қамтамасыз ету комитеті ұсынатын ғылыми басылымдарында 3 мақала, Халықаралық конференция материалдарында 2 баяндама. Диссертацияның практикалық жұмысының нәтижелеріне Қазақстан Республикасының патенті алынды. Диссертацияның қорғауға ұсынылатын ғылыми жұмыстың нәтижелерін жалпылауға қосқан жеке үлесі. Зерттеу жұмысының әдеби көздеріне шолу, қойылған мақсат пен міндеттерді анықтау, эксперименттерді жобалау және жүргізу, практикалық жұмыстың нәтижелерін талдау және өңдеу автордың тікелей қатысуымен жүргізілді. Жұмыстың ғылыми зерттеулер бағдарламасымен байланысы. Бұл жұмыс протеаза класының жаңа ферменттерін алуға және зерттеуге бағытталған. Жұмыс "Ұлттық биотехнология орталығы" жауапкершілігі шектеулі серіктестігінің микроорганизмдердің генетикасы мен биохимиясы зертханасында жүргізілді. Диссертациялық жұмыс AP14869708 "Бактериялық шыққан жаңа протеолитикалық ферменттерді оқшаулау және зерттеу", АР05135454 "Төмен құнды қауырсын-мамық шикізатты ақуыз гидролизатына өңдеу үшін рекомбинантты кератиназа штамм-өндірушісін алу технологиясын әзірлеу" және BR10764944 "Аналитикалық бақылау әдістерін әзірлеу және тамақ өнімдерінің қауіпсіздігіне мониторинг жүргізу" ғылыми-техникалық бағдарламасы шеңберінде орындалды. Диссертацияның көлемі мен құрылымы. Диссертация 134 бетте көрсетілген, 13 кесте, 37 сурет, 3 қосымша бар. Келтірілген дереккөздердің тізіміне 331 сілтеме кіреді. Құрылымдық жағынан диссертация жұмыста қабылданған анықтамалар, белгілер мен қысқартулар тізімінен, кіріспе, әдеби деректерге шолу, эксперименттер жүргізу материалдары мен әдістерінен, өз зерттеулерінің нәтижелерінен, қорытындыдан, пайдаланылған көздер мен қосымшалар тізімінен тұрады.
Зерттеулерді этикалық бағалау жөніндегі комиссияның қорытындысы
Диссертациялық кеңестің шешімі
Диссертация қорғауының бейнежазбасы: https://youtu.be/wKV7DuCuo7s?si=0qEbOhzlhp5M--Hn
